TUTORIAL

   1 Bowtie: an Ultrafast, Lightweight Short Read Aligner
   2
   3 Bowtie Getting Started Guide
   4 ============================
   5
   6  Download and extract the appropriate Bowtie binary release from
   7  http://bowtie-bio.sf.net into a fresh directory. Change to that
   8  directory.
   9
  10  Performing alignments
  11  ---------------------
  12
  13  The Bowtie source and binary packages come with a pre-built index of
  14  the E. coli genome, and a set of 1,000 35-bp reads simulated from that
  15  genome. To use Bowtie to align those reads, issue the following
  16  command.  If you get an error message "command not found", try adding
  17  a "./" before the "bowtie".
  18
  19     bowtie e_coli reads/e_coli_1000.fq
  20
  21  The first argument to bowtie is the basename of the index for the
  22  genome to be searched. The second argument is the name of a FASTQ file
  23  containing the reads.
  24
  25  Depending on your computer, the run might take a few seconds up to
  26  about a minute. You will see bowtie print many lines of output. Each
  27  line is an alignment for a read. The name of the aligned read appears
  28  in the leftmost column. The final line should say "Reported 698
  29  alignments to 1 output stream(s)" or something similar.
  30
  31  Next, issue this command:
  32
  33     bowtie -t e_coli reads/e_coli_1000.fq e_coli.map
  34
  35  This run calculates the same alignments as the previous run, but the
  36  alignments are written to e_coli.map (the final argument) rather than
  37  to the screen. Also, the -t option instructs Bowtie to print timing
  38  statistics.  The output should look something like this:
  39
  40     Time loading forward index: 00:00:00
  41     Time loading mirror index: 00:00:00
  42     Seeded quality full-index search: 00:00:00
  43     # reads processed: 1000
  44     # reads with at least one reported alignment: 699 (69.90%)
  45     # reads that failed to align: 301 (30.10%)
  46     Reported 699 alignments to 1 output stream(s)
  47     Time searching: 00:00:00
  48     Overall time: 00:00:00
  49
  50  Installing a pre-built index
  51  ----------------------------
  52
  53  Download the pre-built S. cerevisiae genome package from the Bowtie
  54  FTP site:
  55
  56     ftp://ftp.cbcb.umd.edu/pub/data/bowtie_indexes/s_cerevisiae.ebwt.zip
  57
  58  All pre-built indexes are packaged as .zip archives, and the S.
  59  cerevisiae archive is named s_cerevisiae.ebwt.zip. When it has
  60  finished downloading, extract the archive into the Bowtie 'indexes'
  61  subdirectory using your preferred unzip tool. The index is now
  62  installed.
  63
  64  To test that the index is properly installed, issue this command from
  65  the Bowtie install directory:
  66
  67     bowtie -c s_cerevisiae ATTGTAGTTCGAGTAAGTAATGTGGGTTTG
  68
  69  This command searches the S. cerevisiae index with a single read. The
  70  -c argument instructs Bowtie to obtain read sequences directly from
  71  the command line rather than from a file. If the index is installed
  72  properly, this command should print a single alignment and then exit.
  73
  74  If you would rather install pre-built indexes somewhere other than the
  75  'indexes' subdirectory of the Bowtie install directory, simply set the
  76  BOWTIE_INDEXES environment variable to point to your preferred
  77  directory and extract indexes there instead.
  78
  79  Building a new index
  80  --------------------
  81
  82  The pre-built E. coli index included with Bowtie is built from the
  83  sequence for strain 536, known to cause urinary tract infections. We
  84  will create a new index from the sequence of E. coli strain O157:H7, a
  85  strain known to cause food poisoning. Download the sequence file from:
  86
  87     ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/Escherichia_coli_O157H7/NC_002127.fna
  88
  89  When the sequence file is finished downloading, move it to the Bowtie
  90  install directory and issue this command:
  91
  92     bowtie-build NC_002127.fna e_coli_O157_H7
  93
  94  The command should finish quickly, and print several lines of status
  95  messages. When the command has completed, note that the current
  96  directory contains four new files named e_coli_O157_H7.1.ebwt,
  97  e_coli_O157_H7.2.ebwt, e_coli_O157_H7.rev.1.ebwt, and
  98  e_coli_O157_H7.rev.2.ebwt. These files constitute the index. Move
  99  these files to the indexes subdirectory to install it.
 100
 101  To test that the index is properly installed, issue this command:
 102
 103     bowtie -c e_coli_O157_H7 GCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCC
 104
 105  If the index is installed properly, this command should print a single
 106  alignment and then exit.
 107
 108  Finding variations with SAMtools
 109  --------------------------------
 110
 111  SAMtools (http://samtools.sf.net) is a suite of tools for storing,
 112  manipulating, and analyzing alignments such as those output by Bowtie.
 113  SAMtools understands alignments in either of two complementary
 114  formats: the human-readable SAM format, or the binary BAM format.
 115  Because Bowtie can output SAM (using the -S/--sam option), and SAM can
 116  can be converted to BAM using SAMtools, Bowtie users can make full use
 117  of the analyses implemented in SAMtools, or in any other tools
 118  supporting SAM or BAM.
 119
 120  We will use SAMtools to find SNPs in a set of simulated reads included
 121  with Bowtie.  The reads cover the first 10,000 bases of the pre-built
 122  E. coli genome and contain 10 SNPs throughout.  First, we run 'bowtie'
 123  to align the reads, being sure to specify the -S option.  We also
 124  specify an output file that we will use as input for the next step
 125  (though pipes can be used to accomplish the same thing without the
 126  intermediate file):
 127
 128     bowtie -S e_coli reads/e_coli_10000snp.fq ec_snp.sam
 129
 130  Next, we convert the SAM file to BAM in preparation for sorting.  We
 131  assume that SAMtools is installed and that the samtools binary is
 132  accessible in the PATH.
 133
 134     samtools view -bS -o ec_snp.bam ec_snp.sam
 135
 136  Next, we sort the BAM file, in preparation for SNP calling:
 137
 138     samtools sort ec_snp.bam ec_snp.sorted
 139
 140  We now have a sorted BAM file called ec_snp.sorted.bam.  Sorted BAM is
 141  a useful format because the alignments are both compressed, which is
 142  convenient for long-term storage, and sorted, which is conveneint for
 143  variant discovery.  Finally, we call variants from the Sorted BAM:
 144
 145     samtools pileup -cv -f genomes/NC_008253.fna ec_snp.sorted.bam
 146
 147  For this sample data, the 'samtools pileup' command should print
 148  records for 10 distinct SNPs, the first being at position 541 in the
 149  reference.
 150
 151  See the SAMtools web site for details on how to use these and other
 152  tools in the SAMtools suite: http://samtools.sf.net/.