bam_plcmd.c

   1 #include <math.h>
   2 #include <stdio.h>
   3 #include <unistd.h>
   4 #include <ctype.h>
   5 #include <string.h>
   6 #include <errno.h>
   7 #include "sam.h"
   8 #include "faidx.h"
   9 #include "bam_maqcns.h"
  10 #include "khash.h"
  11 #include "glf.h"
  12 #include "kstring.h"
  13
  14 typedef int *indel_list_t;
  15 KHASH_MAP_INIT_INT64(64, indel_list_t)
  16
  17 #define BAM_PLF_SIMPLE     0x01
  18 #define BAM_PLF_CNS        0x02
  19 #define BAM_PLF_INDEL_ONLY 0x04
  20 #define BAM_PLF_GLF        0x08
  21 #define BAM_PLF_VAR_ONLY   0x10
  22 #define BAM_PLF_2ND        0x20
  23 #define BAM_PLF_RANBASE    0x40
  24 #define BAM_PLF_1STBASE    0x80
  25 #define BAM_PLF_ALLBASE    0x100
  26 #define BAM_PLF_READPOS    0x200
  27 #define BAM_PLF_NOBAQ      0x400
  28
  29 typedef struct {
  30         bam_header_t *h;
  31         bam_maqcns_t *c;
  32         bam_maqindel_opt_t *ido;
  33         faidx_t *fai;
  34         khash_t(64) *hash;
  35         uint32_t format;
  36         int tid, len, last_pos;
  37         int mask;
  38         int capQ_thres, min_baseQ;
  39     int max_depth;  // for indel calling, ignore reads with the depth too high. 0 for unlimited
  40         char *ref;
  41         glfFile fp_glf; // for glf output only
  42 } pu_data_t;
  43
  44 char **__bam_get_lines(const char *fn, int *_n);
  45 void bam_init_header_hash(bam_header_t *header);
  46 int32_t bam_get_tid(const bam_header_t *header, const char *seq_name);
  47
  48 static khash_t(64) *load_pos(const char *fn, bam_header_t *h)
  49 {
  50         char **list;
  51         int i, j, n, *fields, max_fields;
  52         khash_t(64) *hash;
  53         bam_init_header_hash(h);
  54         list = __bam_get_lines(fn, &n);
  55         hash = kh_init(64);
  56         max_fields = 0; fields = 0;
  57         for (i = 0; i < n; ++i) {
  58                 char *str = list[i];
  59                 int chr, n_fields, ret;
  60                 khint_t k;
  61                 uint64_t x;
  62                 n_fields = ksplit_core(str, 0, &max_fields, &fields);
  63                 if (n_fields < 2) continue;
  64                 chr = bam_get_tid(h, str + fields[0]);
  65                 if (chr < 0) {
  66                         fprintf(stderr, "[load_pos] unknown reference sequence name: %s\n", str + fields[0]);
  67                         continue;
  68                 }
  69                 x = (uint64_t)chr << 32 | (atoi(str + fields[1]) - 1);
  70                 k = kh_put(64, hash, x, &ret);
  71                 if (ret == 0) {
  72                         fprintf(stderr, "[load_pos] position %s:%s has been loaded.\n", str+fields[0], str+fields[1]);
  73                         continue;
  74                 }
  75                 kh_val(hash, k) = 0;
  76                 if (n_fields > 2) {
  77                         // count
  78                         for (j = 2; j < n_fields; ++j) {
  79                                 char *s = str + fields[j];
  80                                 if ((*s != '+' && *s != '-') || !isdigit(s[1])) break;
  81                         }
  82                         if (j > 2) { // update kh_val()
  83                                 int *q, y, z;
  84                                 q = kh_val(hash, k) = (int*)calloc(j - 1, sizeof(int));
  85                                 q[0] = j - 2; z = j; y = 1;
  86                                 for (j = 2; j < z; ++j)
  87                                         q[y++] = atoi(str + fields[j]);
  88                         }
  89                 }
  90                 free(str);
  91         }
  92         free(list); free(fields);
  93         return hash;
  94 }
  95
  96 static inline int printw(int c, FILE *fp)
  97 {
  98         char buf[16];
  99         int l, x;
 100         if (c == 0) return fputc('0', fp);
 101         for (l = 0, x = c < 0? -c : c; x > 0; x /= 10) buf[l++] = x%10 + '0';
 102         if (c < 0) buf[l++] = '-';
 103         buf[l] = 0;
 104         for (x = 0; x < l/2; ++x) {
 105                 int y = buf[x]; buf[x] = buf[l-1-x]; buf[l-1-x] = y;
 106         }
 107         fputs(buf, fp);
 108         return 0;
 109 }
 110
 111 // an analogy to pileup_func() below
 112 static int glt3_func(uint32_t tid, uint32_t pos, int n, const bam_pileup1_t *pu, void *data)
 113 {
 114         pu_data_t *d = (pu_data_t*)data;
 115         bam_maqindel_ret_t *r = 0;
 116         int rb, *proposed_indels = 0;
 117         glf1_t *g;
 118         glf3_t *g3;
 119
 120         if (d->fai == 0) {
 121                 fprintf(stderr, "[glt3_func] reference sequence is required for generating GLT. Abort!\n");
 122                 exit(1);
 123         }
 124         if (d->hash) { // only output a list of sites
 125                 khint_t k = kh_get(64, d->hash, (uint64_t)tid<<32|pos);
 126                 if (k == kh_end(d->hash)) return 0;
 127                 proposed_indels = kh_val(d->hash, k);
 128         }
 129         g3 = glf3_init1();
 130         if (d->fai && (int)tid != d->tid) {
 131                 if (d->ref) { // then write the end mark
 132                         g3->rtype = GLF3_RTYPE_END;
 133                         glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 134                 }
 135                 glf3_ref_write(d->fp_glf, d->h->target_name[tid], d->h->target_len[tid]); // write reference
 136                 free(d->ref);
 137                 d->ref = fai_fetch(d->fai, d->h->target_name[tid], &d->len);
 138                 d->tid = tid;
 139                 d->last_pos = 0;
 140         }
 141         rb = (d->ref && (int)pos < d->len)? d->ref[pos] : 'N';
 142         g = bam_maqcns_glfgen(n, pu, bam_nt16_table[rb], d->c);
 143         memcpy(g3, g, sizeof(glf1_t));
 144         g3->rtype = GLF3_RTYPE_SUB;
 145         g3->offset = pos - d->last_pos;
 146         d->last_pos = pos;
 147         glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 148     if (pos < d->len) {
 149         int m = (!d->max_depth || d->max_depth>n) ? n : d->max_depth;
 150                 if (proposed_indels)
 151                         r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, proposed_indels[0], proposed_indels+1);
 152                 else r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, 0, 0);
 153         }
 154         if (r) { // then write indel line
 155                 int het = 3 * n, min;
 156                 min = het;
 157                 if (min > r->gl[0]) min = r->gl[0];
 158                 if (min > r->gl[1]) min = r->gl[1];
 159                 g3->ref_base = 0;
 160                 g3->rtype = GLF3_RTYPE_INDEL;
 161                 memset(g3->lk, 0, 10);
 162                 g3->lk[0] = r->gl[0] - min < 255? r->gl[0] - min : 255;
 163                 g3->lk[1] = r->gl[1] - min < 255? r->gl[1] - min : 255;
 164                 g3->lk[2] = het - min < 255? het - min : 255;
 165                 g3->offset = 0;
 166                 g3->indel_len[0] = r->indel1;
 167                 g3->indel_len[1] = r->indel2;
 168                 g3->min_lk = min < 255? min : 255;
 169                 g3->max_len = (abs(r->indel1) > abs(r->indel2)? abs(r->indel1) : abs(r->indel2)) + 1;
 170                 g3->indel_seq[0] = strdup(r->s[0]+1);
 171                 g3->indel_seq[1] = strdup(r->s[1]+1);
 172                 glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 173                 bam_maqindel_ret_destroy(r);
 174         }
 175         free(g);
 176         glf3_destroy1(g3);
 177         return 0;
 178 }
 179
 180 static inline void pileup_seq(const bam_pileup1_t *p, int pos, int ref_len, const char *ref)
 181 {
 182         int j;
 183         if (p->is_head) {
 184                 putchar('^');
 185                 putchar(p->b->core.qual > 93? 126 : p->b->core.qual + 33);
 186         }
 187         if (!p->is_del) {
 188                 int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos)];
 189                 if (ref) {
 190                         int rb = pos < ref_len? ref[pos] : 'N';
 191                         if (c == '=' || bam_nt16_table[c] == bam_nt16_table[rb]) c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
 192                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
 193                 } else {
 194                         if (c == '=') c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
 195                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
 196                 }
 197                 putchar(c);
 198         } else putchar(p->is_refskip? (bam1_strand(p->b)? '<' : '>') : '*');
 199         if (p->indel > 0) {
 200                 putchar('+'); printw(p->indel, stdout);
 201                 for (j = 1; j <= p->indel; ++j) {
 202                         int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos + j)];
 203                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
 204                 }
 205         } else if (p->indel < 0) {
 206                 printw(p->indel, stdout);
 207                 for (j = 1; j <= -p->indel; ++j) {
 208                         int c = (ref && (int)pos+j < ref_len)? ref[pos+j] : 'N';
 209                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
 210                 }
 211         }
 212         if (p->is_tail) putchar('$');
 213 }
 214
 215 static int pileup_func(uint32_t tid, uint32_t pos, int n, const bam_pileup1_t *pu, void *data)
 216 {
 217         pu_data_t *d = (pu_data_t*)data;
 218         bam_maqindel_ret_t *r = 0;
 219         int i, rb, rms_mapq = -1, *proposed_indels = 0;
 220         uint64_t rms_aux;
 221         uint32_t cns = 0;
 222
 223         // if GLF is required, suppress -c completely
 224         if (d->format & BAM_PLF_GLF) return glt3_func(tid, pos, n, pu, data);
 225         // if d->hash is initialized, only output the sites in the hash table
 226         if (d->hash) {
 227                 khint_t k = kh_get(64, d->hash, (uint64_t)tid<<32|pos);
 228                 if (k == kh_end(d->hash)) return 0;
 229                 proposed_indels = kh_val(d->hash, k);
 230         }
 231         // update d->ref if necessary
 232         if (d->fai && (int)tid != d->tid) {
 233                 free(d->ref);
 234                 d->ref = faidx_fetch_seq(d->fai, d->h->target_name[tid], 0, 0x7fffffff, &d->len);
 235                 d->tid = tid;
 236         }
 237         rb = (d->ref && (int)pos < d->len)? d->ref[pos] : 'N';
 238         // when the indel-only mode is asked for, return if no reads mapped with indels
 239         if (d->format & BAM_PLF_INDEL_ONLY) {
 240                 for (i = 0; i < n; ++i)
 241                         if (pu[i].indel != 0) break;
 242                 if (i == n) return 0;
 243         }
 244         // call the consensus and indel
 245         if (d->format & BAM_PLF_CNS) { // call consensus
 246                 if (d->format & (BAM_PLF_RANBASE|BAM_PLF_1STBASE)) { // use a random base or the 1st base as the consensus call
 247                         const bam_pileup1_t *p = (d->format & BAM_PLF_1STBASE)? pu : pu + (int)(drand48() * n);
 248                         int q = bam1_qual(p->b)[p->qpos];
 249                         int mapQ = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 250                         uint32_t b = bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos);
 251                         cns = b<<28 | 0xf<<24 | mapQ<<16 | q<<8;
 252                 } else if (d->format & BAM_PLF_ALLBASE) { // collapse all bases
 253                         uint64_t rmsQ = 0;
 254                         uint32_t b = 0;
 255                         for (i = 0; i < n; ++i) {
 256                                 const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 257                                 int q = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 258                                 b |= bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos);
 259                                 rmsQ += q * q;
 260                         }
 261                         rmsQ = (uint64_t)(sqrt((double)rmsQ / n) + .499);
 262                         cns = b<<28 | 0xf<<24 | rmsQ<<16 | 60<<8;
 263                 } else {
 264                         glf1_t *g = bam_maqcns_glfgen(n, pu, bam_nt16_table[rb], d->c);
 265                         cns = g->depth == 0? (0xfu<<28 | 0xf<<24) : glf2cns(g, (int)(d->c->q_r + .499));
 266                         free(g);
 267                 }
 268         }
 269     if ((d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_INDEL_ONLY)) && d->ref && pos < d->len) { // call indels
 270         int m = (!d->max_depth || d->max_depth>n) ? n : d->max_depth;
 271         if (proposed_indels) // the first element gives the size of the array
 272             r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, proposed_indels[0], proposed_indels+1);
 273         else r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, 0, 0);
 274         }
 275         // when only variant sites are asked for, test if the site is a variant
 276         if ((d->format & BAM_PLF_CNS) && (d->format & BAM_PLF_VAR_ONLY)) {
 277                 if (!(bam_nt16_table[rb] != 15 && cns>>28 != 15 && cns>>28 != bam_nt16_table[rb])) { // not a SNP
 278                         if (!(r && (r->gt == 2 || strcmp(r->s[r->gt], "*")))) { // not an indel
 279                                 if (r) bam_maqindel_ret_destroy(r);
 280                                 return 0;
 281                         }
 282                 }
 283         }
 284         // print the first 3 columns
 285         fputs(d->h->target_name[tid], stdout); putchar('\t');
 286         printw(pos+1, stdout); putchar('\t'); putchar(rb); putchar('\t');
 287         // print consensus information if required
 288         if (d->format & BAM_PLF_CNS) {
 289                 putchar(bam_nt16_rev_table[cns>>28]); putchar('\t');
 290                 printw(cns>>8&0xff, stdout); putchar('\t');
 291                 printw(cns&0xff, stdout); putchar('\t');
 292                 printw(cns>>16&0xff, stdout); putchar('\t');
 293         }
 294         // print pileup sequences
 295         printw(n, stdout); putchar('\t');
 296         for (i = 0; i < n; ++i)
 297                 pileup_seq(pu + i, pos, d->len, d->ref);
 298         // finalize rms_mapq
 299         if (d->format & BAM_PLF_CNS) {
 300                 for (i = rms_aux = 0; i < n; ++i) {
 301                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 302                         int tmp = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 303                         rms_aux += tmp * tmp;
 304                 }
 305                 rms_aux = (uint64_t)(sqrt((double)rms_aux / n) + .499);
 306                 if (rms_mapq < 0) rms_mapq = rms_aux;
 307         }
 308         putchar('\t');
 309         // print quality
 310         for (i = 0; i < n; ++i) {
 311                 const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 312                 int c = bam1_qual(p->b)[p->qpos] + 33;
 313                 if (c > 126) c = 126;
 314                 putchar(c);
 315         }
 316         if (d->format & BAM_PLF_2ND) { // print 2nd calls and qualities
 317                 const unsigned char *q;
 318                 putchar('\t');
 319                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 320                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 321                         q = bam_aux_get(p->b, "E2");
 322                         putchar(q? q[p->qpos + 1] : 'N');
 323                 }
 324                 putchar('\t');
 325                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 326                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 327                         q = bam_aux_get(p->b, "U2");
 328                         putchar(q? q[p->qpos + 1] : '!');
 329                 }
 330         }
 331         // print mapping quality if -s is flagged on the command line
 332         if (d->format & BAM_PLF_SIMPLE) {
 333                 putchar('\t');
 334                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 335                         int c = pu[i].b->core.qual + 33;
 336                         if (c > 126) c = 126;
 337                         putchar(c);
 338                 }
 339         }
 340         // print read position
 341         if (d->format & BAM_PLF_READPOS) {
 342                 putchar('\t');
 343                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 344                         int x = pu[i].qpos;
 345                         int l = pu[i].b->core.l_qseq;
 346                         printw(x < l/2? x+1 : -((l-1)-x+1), stdout); putchar(',');
 347                 }
 348         }
 349         putchar('\n');
 350         // print the indel line if r has been calculated. This only happens if:
 351         // a) -c or -i are flagged, AND b) the reference sequence is available
 352         if (r) {
 353                 printf("%s\t%d\t*\t", d->h->target_name[tid], pos + 1);
 354                 if (r->gt < 2) printf("%s/%s\t", r->s[r->gt], r->s[r->gt]);
 355                 else printf("%s/%s\t", r->s[0], r->s[1]);
 356                 printf("%d\t%d\t", r->q_cns, r->q_ref);
 357                 printf("%d\t%d\t", rms_mapq, n);
 358                 printf("%s\t%s\t", r->s[0], r->s[1]);
 359                 //printf("%d\t%d\t", r->gl[0], r->gl[1]);
 360                 printf("%d\t%d\t%d\t", r->cnt1, r->cnt2, r->cnt_anti);
 361                 printf("%d\t%d\n", r->cnt_ref, r->cnt_ambi);
 362                 bam_maqindel_ret_destroy(r);
 363         }
 364         return 0;
 365 }
 366
 367 int bam_pileup(int argc, char *argv[])
 368 {
 369         int c, is_SAM = 0;
 370         char *fn_list = 0, *fn_fa = 0, *fn_pos = 0;
 371         pu_data_t *d = (pu_data_t*)calloc(1, sizeof(pu_data_t));
 372     d->max_depth = 1024; d->tid = -1; d->mask = BAM_DEF_MASK; d->min_baseQ = 13;
 373         d->c = bam_maqcns_init();
 374         d->c->errmod = BAM_ERRMOD_MAQ2; // change the default model
 375         d->ido = bam_maqindel_opt_init();
 376         while ((c = getopt(argc, argv, "st:f:cT:N:r:l:d:im:gI:G:vM:S2aR:PAQ:C:B")) >= 0) {
 377                 switch (c) {
 378                 case 'Q': d->c->min_baseQ = atoi(optarg); break;
 379                 case 'C': d->capQ_thres = atoi(optarg); break;
 380                 case 'B': d->format |= BAM_PLF_NOBAQ; break;
 381                 case 'a': d->c->errmod = BAM_ERRMOD_SOAP; break;
 382                 case 'A': d->c->errmod = BAM_ERRMOD_MAQ; break;
 383                 case 's': d->format |= BAM_PLF_SIMPLE; break;
 384                 case 't': fn_list = strdup(optarg); break;
 385                 case 'l': fn_pos = strdup(optarg); break;
 386                 case 'f': fn_fa = strdup(optarg); break;
 387                 case 'T': d->c->theta = atof(optarg); break;
 388                 case 'N': d->c->n_hap = atoi(optarg); break;
 389                 case 'r': d->c->het_rate = atof(optarg); d->ido->r_snp = d->c->het_rate; break;
 390                 case 'M': d->c->cap_mapQ = atoi(optarg); break;
 391                 case 'd': d->max_depth = atoi(optarg); break;
 392                 case 'c': d->format |= BAM_PLF_CNS; break;
 393                 case 'i': d->format |= BAM_PLF_INDEL_ONLY; break;
 394                 case 'v': d->format |= BAM_PLF_VAR_ONLY; break;
 395                 case 'm': d->mask = strtol(optarg, 0, 0); break;
 396                 case 'g': d->format |= BAM_PLF_GLF; break;
 397                 case '2': d->format |= BAM_PLF_2ND; break;
 398                 case 'P': d->format |= BAM_PLF_READPOS; break;
 399                 case 'I': d->ido->q_indel = atoi(optarg); break;
 400                 case 'G': d->ido->r_indel = atof(optarg); break;
 401                 case 'S': is_SAM = 1; break;
 402                 case 'R':
 403                         if (strcmp(optarg, "random") == 0) d->format |= BAM_PLF_RANBASE;
 404                         else if (strcmp(optarg, "first") == 0) d->format |= BAM_PLF_1STBASE;
 405                         else if (strcmp(optarg, "all") == 0) d->format |= BAM_PLF_ALLBASE;
 406                         else fprintf(stderr, "[bam_pileup] unrecognized -R\n");
 407                         break;
 408                 default: fprintf(stderr, "Unrecognizd option '-%c'.\n", c); return 1;
 409                 }
 410         }
 411         if (d->c->errmod != BAM_ERRMOD_MAQ2) d->c->theta += 0.02;
 412         if (d->c->theta > 1.0) d->c->theta = 1.0;
 413         if (fn_list) is_SAM = 1;
 414         if (optind == argc) {
 415                 fprintf(stderr, "\n");
 416                 fprintf(stderr, "Usage:  samtools pileup [options] <in.bam>|<in.sam>\n\n");
 417                 fprintf(stderr, "Option: -s        simple (yet incomplete) pileup format\n");
 418                 fprintf(stderr, "        -S        the input is in SAM\n");
 419                 fprintf(stderr, "        -B        disable BAQ computation\n");
 420                 fprintf(stderr, "        -A        use the original MAQ model for SNP calling (DEPRECATED)\n");
 421                 fprintf(stderr, "        -2        output the 2nd best call and quality\n");
 422                 fprintf(stderr, "        -i        only show lines/consensus with indels\n");
 423                 fprintf(stderr, "        -Q INT    min base quality (possibly capped by BAQ) [%d]\n", d->c->min_baseQ);
 424                 fprintf(stderr, "        -C INT    coefficient for adjusting mapQ of poor mappings [%d]\n", d->capQ_thres);
 425                 fprintf(stderr, "        -m INT    filtering reads with bits in INT [0x%x]\n", d->mask);
 426                 fprintf(stderr, "        -M INT    cap mapping quality at INT [%d]\n", d->c->cap_mapQ);
 427         fprintf(stderr, "        -d INT    limit maximum depth for indels [%d]\n", d->max_depth);
 428                 fprintf(stderr, "        -t FILE   list of reference sequences (force -S)\n");
 429                 fprintf(stderr, "        -l FILE   list of sites at which pileup is output\n");
 430                 fprintf(stderr, "        -f FILE   reference sequence in the FASTA format\n\n");
 431                 fprintf(stderr, "        -c        compute the consensus sequence\n");
 432                 fprintf(stderr, "        -v        print variants only (for -c)\n");
 433                 fprintf(stderr, "        -g        output in the GLFv3 format (DEPRECATED)\n");
 434                 fprintf(stderr, "        -T FLOAT  theta in maq consensus calling model (for -c) [%.4g]\n", d->c->theta);
 435                 fprintf(stderr, "        -N INT    number of haplotypes in the sample (for -c) [%d]\n", d->c->n_hap);
 436                 fprintf(stderr, "        -r FLOAT  prior of a difference between two haplotypes (for -c) [%.4g]\n", d->c->het_rate);
 437                 fprintf(stderr, "        -G FLOAT  prior of an indel between two haplotypes (for -c) [%.4g]\n", d->ido->r_indel);
 438                 fprintf(stderr, "        -I INT    phred prob. of an indel in sequencing/prep. (for -c) [%d]\n", d->ido->q_indel);
 439                 fprintf(stderr, "\n");
 440                 free(fn_list); free(fn_fa); free(d);
 441                 return 1;
 442         }
 443         if (d->format & (BAM_PLF_RANBASE|BAM_PLF_1STBASE|BAM_PLF_ALLBASE)) d->format |= BAM_PLF_CNS;
 444         if (fn_fa) d->fai = fai_load(fn_fa);
 445         if (d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_GLF)) bam_maqcns_prepare(d->c); // consensus calling
 446         if (d->format & BAM_PLF_GLF) { // for glf output
 447                 glf3_header_t *h;
 448                 h = glf3_header_init();
 449                 d->fp_glf = bgzf_fdopen(fileno(stdout), "w");
 450                 glf3_header_write(d->fp_glf, h);
 451                 glf3_header_destroy(h);
 452         }
 453         if (d->fai == 0 && (d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_INDEL_ONLY)))
 454                 fprintf(stderr, "[bam_pileup] indels will not be called when -f is absent.\n");
 455         if (fn_fa && is_SAM && fn_list == 0) fn_list = samfaipath(fn_fa);
 456
 457         {
 458                 samfile_t *fp;
 459                 fp = is_SAM? samopen(argv[optind], "r", fn_list) : samopen(argv[optind], "rb", 0);
 460                 if (fp == 0 || fp->header == 0) {
 461                         fprintf(stderr, "[bam_pileup] fail to read the header: non-exisiting file or wrong format.\n");
 462                         return 1;
 463                 }
 464                 d->h = fp->header;
 465                 if (fn_pos) d->hash = load_pos(fn_pos, d->h);
 466                 { // run pileup
 467                         extern int bam_prob_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 468                         extern int bam_cap_mapQ(bam1_t *b, char *ref, int thres);
 469                         bam1_t *b;
 470                         int ret, tid, pos, n_plp;
 471                         bam_plp_t iter;
 472                         const bam_pileup1_t *plp;
 473                         b = bam_init1();
 474                         iter = bam_plp_init(0, 0);
 475                         bam_plp_set_mask(iter, d->mask);
 476                         while ((ret = samread(fp, b)) >= 0) {
 477                                 int skip = 0;
 478                                 if ((int)b->core.tid < 0) break;
 479                                 // update d->ref if necessary
 480                                 if (d->fai && (int)b->core.tid != d->tid) {
 481                                         free(d->ref);
 482                                         d->ref = faidx_fetch_seq(d->fai, d->h->target_name[b->core.tid], 0, 0x7fffffff, &d->len);
 483                                         d->tid = b->core.tid;
 484                                 }
 485                                 if (d->ref && (d->format&BAM_PLF_CNS) && !(d->format&BAM_PLF_NOBAQ)) bam_prob_realn(b, d->ref);
 486                                 if (d->ref && (d->format&BAM_PLF_CNS) && d->capQ_thres > 10) {
 487                                         int q = bam_cap_mapQ(b, d->ref, d->capQ_thres);
 488                                         if (q < 0) skip = 1;
 489                                         else if (b->core.qual > q) b->core.qual = q;
 490                                 } else if (b->core.flag&BAM_FUNMAP) skip = 1;
 491                                 else if ((d->format&BAM_PLF_CNS) && (b->core.flag&1) && !(b->core.flag&2)) skip = 1;
 492                                 if (skip) continue;
 493                                 bam_plp_push(iter, b);
 494                                 while ((plp = bam_plp_next(iter, &tid, &pos, &n_plp)) != 0)
 495                                         pileup_func(tid, pos, n_plp, plp, d);
 496                         }
 497                         bam_plp_push(iter, 0);
 498                         while ((plp = bam_plp_next(iter, &tid, &pos, &n_plp)) != 0)
 499                                 pileup_func(tid, pos, n_plp, plp, d);
 500                         bam_plp_destroy(iter);
 501                         bam_destroy1(b);
 502                 }
 503                 samclose(fp); // d->h will be destroyed here
 504         }
 505
 506         // free
 507         if (d->format & BAM_PLF_GLF) bgzf_close(d->fp_glf);
 508         if (fn_pos) { // free the hash table
 509                 khint_t k;
 510                 for (k = kh_begin(d->hash); k < kh_end(d->hash); ++k)
 511                         if (kh_exist(d->hash, k)) free(kh_val(d->hash, k));
 512                 kh_destroy(64, d->hash);
 513         }
 514         free(fn_pos); free(fn_list); free(fn_fa);
 515         if (d->fai) fai_destroy(d->fai);
 516         bam_maqcns_destroy(d->c);
 517         free(d->ido); free(d->ref); free(d);
 518         return 0;
 519 }
 520
 521 /***********
 522  * mpileup *
 523  ***********/
 524
 525 #include <assert.h>
 526 #include "bam2bcf.h"
 527 #include "sample.h"
 528
 529 #define MPLP_GLF   0x10
 530 #define MPLP_NO_COMP 0x20
 531 #define MPLP_NO_ORPHAN 0x40
 532 #define MPLP_REALN   0x80
 533 #define MPLP_FMT_DP 0x100
 534 #define MPLP_FMT_SP 0x200
 535 #define MPLP_NO_INDEL 0x400
 536
 537 typedef struct {
 538         int max_mq, min_mq, flag, min_baseQ, capQ_thres, max_depth;
 539         int openQ, extQ, tandemQ;
 540         char *reg, *fn_pos, *pl_list;
 541         faidx_t *fai;
 542         kh_64_t *hash;
 543 } mplp_conf_t;
 544
 545 typedef struct {
 546         bamFile fp;
 547         bam_iter_t iter;
 548         int min_mq, flag, ref_id, capQ_thres;
 549         char *ref;
 550 } mplp_aux_t;
 551
 552 typedef struct {
 553         int n;
 554         int *n_plp, *m_plp;
 555         bam_pileup1_t **plp;
 556 } mplp_pileup_t;
 557
 558 static int mplp_func(void *data, bam1_t *b)
 559 {
 560         extern int bam_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 561         extern int bam_prob_realn_core(bam1_t *b, const char *ref, int);
 562         extern int bam_cap_mapQ(bam1_t *b, char *ref, int thres);
 563         mplp_aux_t *ma = (mplp_aux_t*)data;
 564         int ret, skip = 0;
 565         do {
 566                 int has_ref;
 567                 ret = ma->iter? bam_iter_read(ma->fp, ma->iter, b) : bam_read1(ma->fp, b);
 568                 if (ret < 0) break;
 569                 has_ref = (ma->ref && ma->ref_id == b->core.tid)? 1 : 0;
 570                 skip = 0;
 571                 if (has_ref && (ma->flag&MPLP_REALN)) bam_prob_realn_core(b, ma->ref, 1);
 572                 if (has_ref && ma->capQ_thres > 10) {
 573                         int q = bam_cap_mapQ(b, ma->ref, ma->capQ_thres);
 574                         if (q < 0) skip = 1;
 575                         else if (b->core.qual > q) b->core.qual = q;
 576                 } else if (b->core.flag&BAM_FUNMAP) skip = 1;
 577                 else if (b->core.qual < ma->min_mq) skip = 1;
 578                 else if ((ma->flag&MPLP_NO_ORPHAN) && (b->core.flag&1) && !(b->core.flag&2)) skip = 1;
 579         } while (skip);
 580         return ret;
 581 }
 582
 583 static void group_smpl(mplp_pileup_t *m, bam_sample_t *sm, kstring_t *buf,
 584                                            int n, char *const*fn, int *n_plp, const bam_pileup1_t **plp)
 585 {
 586         int i, j;
 587         memset(m->n_plp, 0, m->n * sizeof(int));
 588         for (i = 0; i < n; ++i) {
 589                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 590                         const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 591                         uint8_t *q;
 592                         int id = -1;
 593                         q = bam_aux_get(p->b, "RG");
 594                         if (q) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], (char*)q+1, buf);
 595                         if (id < 0) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], 0, buf);
 596                         assert(id >= 0 && id < m->n);
 597                         if (m->n_plp[id] == m->m_plp[id]) {
 598                                 m->m_plp[id] = m->m_plp[id]? m->m_plp[id]<<1 : 8;
 599                                 m->plp[id] = realloc(m->plp[id], sizeof(bam_pileup1_t) * m->m_plp[id]);
 600                         }
 601                         m->plp[id][m->n_plp[id]++] = *p;
 602                 }
 603         }
 604 }
 605
 606 static int mpileup(mplp_conf_t *conf, int n, char **fn)
 607 {
 608         extern void *bcf_call_add_rg(void *rghash, const char *hdtext, const char *list);
 609         extern void bcf_call_del_rghash(void *rghash);
 610         mplp_aux_t **data;
 611         int i, tid, pos, *n_plp, beg0 = 0, end0 = 1u<<29, ref_len, ref_tid, max_depth;
 612         const bam_pileup1_t **plp;
 613         bam_mplp_t iter;
 614         bam_header_t *h = 0;
 615         char *ref;
 616         khash_t(64) *hash = 0;
 617         void *rghash = 0;
 618
 619         bcf_callaux_t *bca = 0;
 620         bcf_callret1_t *bcr = 0;
 621         bcf_call_t bc;
 622         bcf_t *bp = 0;
 623         bcf_hdr_t *bh = 0;
 624
 625         bam_sample_t *sm = 0;
 626         kstring_t buf;
 627         mplp_pileup_t gplp;
 628
 629         memset(&gplp, 0, sizeof(mplp_pileup_t));
 630         memset(&buf, 0, sizeof(kstring_t));
 631         memset(&bc, 0, sizeof(bcf_call_t));
 632         data = calloc(n, sizeof(void*));
 633         plp = calloc(n, sizeof(void*));
 634         n_plp = calloc(n, sizeof(int*));
 635         sm = bam_smpl_init();
 636
 637         // read the header and initialize data
 638         for (i = 0; i < n; ++i) {
 639                 bam_header_t *h_tmp;
 640                 data[i] = calloc(1, sizeof(mplp_aux_t));
 641                 data[i]->min_mq = conf->min_mq;
 642                 data[i]->flag = conf->flag;
 643                 data[i]->capQ_thres = conf->capQ_thres;
 644                 data[i]->fp = strcmp(fn[i], "-") == 0? bam_dopen(fileno(stdin), "r") : bam_open(fn[i], "r");
 645                 h_tmp = bam_header_read(data[i]->fp);
 646                 bam_smpl_add(sm, fn[i], h_tmp->text);
 647                 rghash = bcf_call_add_rg(rghash, h_tmp->text, conf->pl_list);
 648                 if (conf->reg) {
 649                         int beg, end;
 650                         bam_index_t *idx;
 651                         idx = bam_index_load(fn[i]);
 652                         if (idx == 0) {
 653                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to load index for %d-th input.\n", __func__, i+1);
 654                                 exit(1);
 655                         }
 656                         if (bam_parse_region(h_tmp, conf->reg, &tid, &beg, &end) < 0) {
 657                                 fprintf(stderr, "[%s] malformatted region or wrong seqname for %d-th input.\n", __func__, i+1);
 658                                 exit(1);
 659                         }
 660                         if (i == 0) beg0 = beg, end0 = end;
 661                         data[i]->iter = bam_iter_query(idx, tid, beg, end);
 662                         bam_index_destroy(idx);
 663                 }
 664                 if (i == 0) h = h_tmp;
 665                 else {
 666                         // FIXME: to check consistency
 667                         bam_header_destroy(h_tmp);
 668                 }
 669         }
 670         gplp.n = sm->n;
 671         gplp.n_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 672         gplp.m_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 673         gplp.plp = calloc(sm->n, sizeof(void*));
 674
 675         fprintf(stderr, "[%s] %d samples in %d input files\n", __func__, sm->n, n);
 676         if (conf->fn_pos) hash = load_pos(conf->fn_pos, h);
 677         // write the VCF header
 678         if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 679                 kstring_t s;
 680                 bh = calloc(1, sizeof(bcf_hdr_t));
 681                 s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 682                 bp = bcf_open("-", (conf->flag&MPLP_NO_COMP)? "wu" : "w");
 683                 for (i = 0; i < h->n_targets; ++i) {
 684                         kputs(h->target_name[i], &s);
 685                         kputc('\0', &s);
 686                 }
 687                 bh->l_nm = s.l;
 688                 bh->name = malloc(s.l);
 689                 memcpy(bh->name, s.s, s.l);
 690                 s.l = 0;
 691                 for (i = 0; i < sm->n; ++i) {
 692                         kputs(sm->smpl[i], &s); kputc('\0', &s);
 693                 }
 694                 bh->l_smpl = s.l;
 695                 bh->sname = malloc(s.l);
 696                 memcpy(bh->sname, s.s, s.l);
 697                 bh->l_txt = 0;
 698                 free(s.s);
 699                 bcf_hdr_sync(bh);
 700                 bcf_hdr_write(bp, bh);
 701                 bca = bcf_call_init(-1., conf->min_baseQ);
 702                 bcr = calloc(sm->n, sizeof(bcf_callret1_t));
 703                 bca->rghash = rghash;
 704                 bca->openQ = conf->openQ, bca->extQ = conf->extQ, bca->tandemQ = conf->tandemQ;
 705         }
 706         ref_tid = -1; ref = 0;
 707         iter = bam_mplp_init(n, mplp_func, (void**)data);
 708         max_depth = conf->max_depth;
 709         if (max_depth * sm->n > 1<<20)
 710                 fprintf(stderr, "(%s) Max depth is above 1M. Potential memory hog!\n", __func__);
 711         if (max_depth * sm->n < 8000) {
 712                 max_depth = 8000 / sm->n;
 713                 fprintf(stderr, "<%s> Set max per-sample depth to %d\n", __func__, max_depth);
 714         }
 715         bam_mplp_set_maxcnt(iter, max_depth);
 716         while (bam_mplp_auto(iter, &tid, &pos, n_plp, plp) > 0) {
 717                 if (conf->reg && (pos < beg0 || pos >= end0)) continue; // out of the region requested
 718                 if (hash) {
 719                         khint_t k;
 720                         k = kh_get(64, hash, (uint64_t)tid<<32 | pos);
 721                         if (k == kh_end(hash)) continue;
 722                 }
 723                 if (tid != ref_tid) {
 724                         free(ref); ref = 0;
 725                         if (conf->fai) ref = fai_fetch(conf->fai, h->target_name[tid], &ref_len);
 726                         for (i = 0; i < n; ++i) data[i]->ref = ref, data[i]->ref_id = tid;
 727                         ref_tid = tid;
 728                 }
 729                 if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 730                         int _ref0, ref16;
 731                         bcf1_t *b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 732                         group_smpl(&gplp, sm, &buf, n, fn, n_plp, plp);
 733                         _ref0 = (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N';
 734                         ref16 = bam_nt16_table[_ref0];
 735                         for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 736                                 bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], ref16, bca, bcr + i);
 737                         bcf_call_combine(gplp.n, bcr, ref16, &bc);
 738                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b, (conf->flag&(MPLP_FMT_DP|MPLP_FMT_SP))? bcr : 0,
 739                                                  (conf->flag&MPLP_FMT_SP), 0, 0);
 740                         bcf_write(bp, bh, b);
 741                         bcf_destroy(b);
 742                         // call indels
 743                         if (!(conf->flag&MPLP_NO_INDEL) && bcf_call_gap_prep(gplp.n, gplp.n_plp, gplp.plp, pos, bca, ref, rghash) >= 0) {
 744                                 for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 745                                         bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], -1, bca, bcr + i);
 746                                 if (bcf_call_combine(gplp.n, bcr, -1, &bc) >= 0) {
 747                                         b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 748                                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b, (conf->flag&(MPLP_FMT_DP|MPLP_FMT_SP))? bcr : 0,
 749                                                                  (conf->flag&MPLP_FMT_SP), bca, ref);
 750                                         bcf_write(bp, bh, b);
 751                                         bcf_destroy(b);
 752                                 }
 753                         }
 754                 } else {
 755                         printf("%s\t%d\t%c", h->target_name[tid], pos + 1, (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N');
 756                         for (i = 0; i < n; ++i) {
 757                                 int j;
 758                                 printf("\t%d\t", n_plp[i]);
 759                                 if (n_plp[i] == 0) printf("*\t*");
 760                                 else {
 761                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j)
 762                                                 pileup_seq(plp[i] + j, pos, ref_len, ref);
 763                                         putchar('\t');
 764                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 765                                                 const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 766                                                 int c = bam1_qual(p->b)[p->qpos] + 33;
 767                                                 if (c > 126) c = 126;
 768                                                 putchar(c);
 769                                         }
 770                                 }
 771                         }
 772                         putchar('\n');
 773                 }
 774         }
 775
 776         bcf_close(bp);
 777         bam_smpl_destroy(sm); free(buf.s);
 778         for (i = 0; i < gplp.n; ++i) free(gplp.plp[i]);
 779         free(gplp.plp); free(gplp.n_plp); free(gplp.m_plp);
 780         bcf_call_del_rghash(rghash);
 781         if (hash) { // free the hash table
 782                 khint_t k;
 783                 for (k = kh_begin(hash); k < kh_end(hash); ++k)
 784                         if (kh_exist(hash, k)) free(kh_val(hash, k));
 785                 kh_destroy(64, hash);
 786         }
 787         bcf_hdr_destroy(bh); bcf_call_destroy(bca); free(bc.PL); free(bcr);
 788         bam_mplp_destroy(iter);
 789         bam_header_destroy(h);
 790         for (i = 0; i < n; ++i) {
 791                 bam_close(data[i]->fp);
 792                 if (data[i]->iter) bam_iter_destroy(data[i]->iter);
 793                 free(data[i]);
 794         }
 795         free(data); free(plp); free(ref); free(n_plp);
 796         return 0;
 797 }
 798
 799 #define MAX_PATH_LEN 1024
 800 int read_file_list(const char *file_list,int *n,char **argv[])
 801 {
 802     char buf[MAX_PATH_LEN];
 803     int len, nfiles;
 804     char **files;
 805
 806     FILE *fh = fopen(file_list,"r");
 807     if ( !fh )
 808     {
 809         fprintf(stderr,"%s: %s\n", file_list,strerror(errno));
 810         return 1;
 811     }
 812
 813     // Speed is not an issue here, determine the number of files by reading the file twice
 814     nfiles = 0;
 815     while ( fgets(buf,MAX_PATH_LEN,fh) ) nfiles++;
 816
 817     if ( fseek(fh, 0L, SEEK_SET) )
 818     {
 819         fprintf(stderr,"%s: %s\n", file_list,strerror(errno));
 820         return 1;
 821     }
 822
 823     files = calloc(nfiles,sizeof(char*));
 824     nfiles = 0;
 825     while ( fgets(buf,MAX_PATH_LEN,fh) )
 826     {
 827         len = strlen(buf);
 828         while ( len>0 && isspace(buf[len-1]) ) len--;
 829         if ( !len ) continue;
 830
 831         files[nfiles] = malloc(sizeof(char)*(len+1));
 832         strncpy(files[nfiles],buf,len);
 833         files[nfiles][len] = 0;
 834         nfiles++;
 835     }
 836     fclose(fh);
 837     if ( !nfiles )
 838     {
 839         fprintf(stderr,"No files read from %s\n", file_list);
 840         return 1;
 841     }
 842     *argv = files;
 843     *n    = nfiles;
 844     return 0;
 845 }
 846 #undef MAX_PATH_LEN
 847
 848 int bam_mpileup(int argc, char *argv[])
 849 {
 850         int c;
 851     const char *file_list = NULL;
 852     char **fn = NULL;
 853     int nfiles = 0;
 854         mplp_conf_t mplp;
 855         memset(&mplp, 0, sizeof(mplp_conf_t));
 856         mplp.max_mq = 60;
 857         mplp.min_baseQ = 13;
 858         mplp.capQ_thres = 0;
 859         mplp.max_depth = 250;
 860         mplp.openQ = 40; mplp.extQ = 20; mplp.tandemQ = 100;
 861         mplp.flag = MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN;
 862         while ((c = getopt(argc, argv, "gf:r:l:M:q:Q:uaORC:BDSd:b:P:o:e:h:I")) >= 0) {
 863                 switch (c) {
 864                 case 'f':
 865                         mplp.fai = fai_load(optarg);
 866                         if (mplp.fai == 0) return 1;
 867                         break;
 868                 case 'd': mplp.max_depth = atoi(optarg); break;
 869                 case 'r': mplp.reg = strdup(optarg); break;
 870                 case 'l': mplp.fn_pos = strdup(optarg); break;
 871                 case 'P': mplp.pl_list = strdup(optarg); break;
 872                 case 'g': mplp.flag |= MPLP_GLF; break;
 873                 case 'u': mplp.flag |= MPLP_NO_COMP | MPLP_GLF; break;
 874                 case 'a': mplp.flag |= MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN; break;
 875                 case 'B': mplp.flag &= ~MPLP_REALN & ~MPLP_NO_ORPHAN; break;
 876                 case 'O': mplp.flag |= MPLP_NO_ORPHAN; break;
 877                 case 'R': mplp.flag |= MPLP_REALN; break;
 878                 case 'D': mplp.flag |= MPLP_FMT_DP; break;
 879                 case 'S': mplp.flag |= MPLP_FMT_SP; break;
 880                 case 'I': mplp.flag |= MPLP_NO_INDEL; break;
 881                 case 'C': mplp.capQ_thres = atoi(optarg); break;
 882                 case 'M': mplp.max_mq = atoi(optarg); break;
 883                 case 'q': mplp.min_mq = atoi(optarg); break;
 884                 case 'Q': mplp.min_baseQ = atoi(optarg); break;
 885         case 'b': file_list = optarg; break;
 886                 case 'o': mplp.openQ = atoi(optarg); break;
 887                 case 'e': mplp.extQ = atoi(optarg); break;
 888                 case 'h': mplp.tandemQ = atoi(optarg); break;
 889                 }
 890         }
 891         if (argc == 1) {
 892                 fprintf(stderr, "\n");
 893                 fprintf(stderr, "Usage:   samtools mpileup [options] in1.bam [in2.bam [...]]\n\n");
 894                 fprintf(stderr, "Options: -f FILE     reference sequence file [null]\n");
 895                 fprintf(stderr, "         -r STR      region in which pileup is generated [null]\n");
 896                 fprintf(stderr, "         -l FILE     list of positions (format: chr pos) [null]\n");
 897                 fprintf(stderr, "         -b FILE     list of input BAM files [null]\n");
 898                 fprintf(stderr, "         -M INT      cap mapping quality at INT [%d]\n", mplp.max_mq);
 899                 fprintf(stderr, "         -Q INT      min base quality [%d]\n", mplp.min_baseQ);
 900                 fprintf(stderr, "         -q INT      filter out alignment with MQ smaller than INT [%d]\n", mplp.min_mq);
 901                 fprintf(stderr, "         -d INT      max per-sample depth [%d]\n", mplp.max_depth);
 902                 fprintf(stderr, "         -P STR      comma separated list of platforms for indels [all]\n");
 903                 fprintf(stderr, "         -o INT      Phred-scaled gap open sequencing error probability [%d]\n", mplp.openQ);
 904                 fprintf(stderr, "         -e INT      Phred-scaled gap extension seq error probability [%d]\n", mplp.extQ);
 905                 fprintf(stderr, "         -h INT      coefficient for homopolyer errors [%d]\n", mplp.tandemQ);
 906                 fprintf(stderr, "         -g          generate BCF output\n");
 907                 fprintf(stderr, "         -u          do not compress BCF output\n");
 908                 fprintf(stderr, "         -B          disable BAQ computation\n");
 909                 fprintf(stderr, "         -D          output per-sample DP\n");
 910                 fprintf(stderr, "         -S          output per-sample SP (strand bias P-value, slow)\n");
 911                 fprintf(stderr, "         -I          do not perform indel calling\n");
 912                 fprintf(stderr, "\n");
 913                 fprintf(stderr, "Notes: Assuming diploid individuals.\n\n");
 914                 return 1;
 915         }
 916     if ( file_list )
 917     {
 918         if ( read_file_list(file_list,&nfiles,&fn) ) return 1;
 919         mpileup(&mplp,nfiles,fn);
 920         for (c=0; c<nfiles; c++) free(fn[c]);
 921         free(fn);
 922     }
 923     else
 924             mpileup(&mplp, argc - optind, argv + optind);
 925         free(mplp.reg); free(mplp.pl_list);
 926         if (mplp.fai) fai_destroy(mplp.fai);
 927         return 0;
 928 }