bam_plcmd.c

   1 #include <math.h>
   2 #include <stdio.h>
   3 #include <unistd.h>
   4 #include <ctype.h>
   5 #include <string.h>
   6 #include <errno.h>
   7 #include "sam.h"
   8 #include "faidx.h"
   9 #include "kstring.h"
  10
  11 static inline int printw(int c, FILE *fp)
  12 {
  13         char buf[16];
  14         int l, x;
  15         if (c == 0) return fputc('0', fp);
  16         for (l = 0, x = c < 0? -c : c; x > 0; x /= 10) buf[l++] = x%10 + '0';
  17         if (c < 0) buf[l++] = '-';
  18         buf[l] = 0;
  19         for (x = 0; x < l/2; ++x) {
  20                 int y = buf[x]; buf[x] = buf[l-1-x]; buf[l-1-x] = y;
  21         }
  22         fputs(buf, fp);
  23         return 0;
  24 }
  25
  26 static inline void pileup_seq(const bam_pileup1_t *p, int pos, int ref_len, const char *ref)
  27 {
  28         int j;
  29         if (p->is_head) {
  30                 putchar('^');
  31                 putchar(p->b->core.qual > 93? 126 : p->b->core.qual + 33);
  32         }
  33         if (!p->is_del) {
  34                 int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos)];
  35                 if (ref) {
  36                         int rb = pos < ref_len? ref[pos] : 'N';
  37                         if (c == '=' || bam_nt16_table[c] == bam_nt16_table[rb]) c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
  38                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
  39                 } else {
  40                         if (c == '=') c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
  41                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
  42                 }
  43                 putchar(c);
  44         } else putchar(p->is_refskip? (bam1_strand(p->b)? '<' : '>') : '*');
  45         if (p->indel > 0) {
  46                 putchar('+'); printw(p->indel, stdout);
  47                 for (j = 1; j <= p->indel; ++j) {
  48                         int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos + j)];
  49                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
  50                 }
  51         } else if (p->indel < 0) {
  52                 printw(p->indel, stdout);
  53                 for (j = 1; j <= -p->indel; ++j) {
  54                         int c = (ref && (int)pos+j < ref_len)? ref[pos+j] : 'N';
  55                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
  56                 }
  57         }
  58         if (p->is_tail) putchar('$');
  59 }
  60
  61 #include <assert.h>
  62 #include "bam2bcf.h"
  63 #include "sample.h"
  64
  65 #define MPLP_GLF   0x10
  66 #define MPLP_NO_COMP 0x20
  67 #define MPLP_NO_ORPHAN 0x40
  68 #define MPLP_REALN   0x80
  69 #define MPLP_FMT_DP 0x100
  70 #define MPLP_FMT_SP 0x200
  71 #define MPLP_NO_INDEL 0x400
  72 #define MPLP_EXT_BAQ 0x800
  73 #define MPLP_ILLUMINA13 0x1000
  74 #define MPLP_IGNORE_RG 0x2000
  75 #define MPLP_PRINT_POS 0x4000
  76 #define MPLP_PRINT_MAPQ 0x8000
  77
  78 void *bed_read(const char *fn);
  79 void bed_destroy(void *_h);
  80 int bed_overlap(const void *_h, const char *chr, int beg, int end);
  81
  82 typedef struct {
  83         int max_mq, min_mq, flag, min_baseQ, capQ_thres, max_depth, max_indel_depth;
  84         int openQ, extQ, tandemQ, min_support; // for indels
  85         double min_frac; // for indels
  86         char *reg, *pl_list;
  87         faidx_t *fai;
  88         void *bed, *rghash;
  89 } mplp_conf_t;
  90
  91 typedef struct {
  92         bamFile fp;
  93         bam_iter_t iter;
  94         bam_header_t *h;
  95         int ref_id;
  96         char *ref;
  97         const mplp_conf_t *conf;
  98 } mplp_aux_t;
  99
 100 typedef struct {
 101         int n;
 102         int *n_plp, *m_plp;
 103         bam_pileup1_t **plp;
 104 } mplp_pileup_t;
 105
 106 static int mplp_func(void *data, bam1_t *b)
 107 {
 108         extern int bam_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 109         extern int bam_prob_realn_core(bam1_t *b, const char *ref, int);
 110         extern int bam_cap_mapQ(bam1_t *b, char *ref, int thres);
 111         mplp_aux_t *ma = (mplp_aux_t*)data;
 112         int ret, skip = 0;
 113         do {
 114                 int has_ref;
 115                 ret = ma->iter? bam_iter_read(ma->fp, ma->iter, b) : bam_read1(ma->fp, b);
 116                 if (ret < 0) break;
 117                 if (b->core.tid < 0 || (b->core.flag&BAM_FUNMAP)) { // exclude unmapped reads
 118                         skip = 1;
 119                         continue;
 120                 }
 121                 if (ma->conf->bed) { // test overlap
 122                         skip = !bed_overlap(ma->conf->bed, ma->h->target_name[b->core.tid], b->core.pos, bam_calend(&b->core, bam1_cigar(b)));
 123                         if (skip) continue;
 124                 }
 125                 if (ma->conf->rghash) { // exclude read groups
 126                         uint8_t *rg = bam_aux_get(b, "RG");
 127                         skip = (rg && bcf_str2id(ma->conf->rghash, (const char*)(rg+1)) >= 0);
 128                         if (skip) continue;
 129                 }
 130                 if (ma->conf->flag & MPLP_ILLUMINA13) {
 131                         int i;
 132                         uint8_t *qual = bam1_qual(b);
 133                         for (i = 0; i < b->core.l_qseq; ++i)
 134                                 qual[i] = qual[i] > 31? qual[i] - 31 : 0;
 135                 }
 136                 has_ref = (ma->ref && ma->ref_id == b->core.tid)? 1 : 0;
 137                 skip = 0;
 138                 if (has_ref && (ma->conf->flag&MPLP_REALN)) bam_prob_realn_core(b, ma->ref, (ma->conf->flag & MPLP_EXT_BAQ)? 3 : 1);
 139                 if (has_ref && ma->conf->capQ_thres > 10) {
 140                         int q = bam_cap_mapQ(b, ma->ref, ma->conf->capQ_thres);
 141                         if (q < 0) skip = 1;
 142                         else if (b->core.qual > q) b->core.qual = q;
 143                 }
 144                 else if (b->core.qual < ma->conf->min_mq) skip = 1;
 145                 else if ((ma->conf->flag&MPLP_NO_ORPHAN) && (b->core.flag&1) && !(b->core.flag&2)) skip = 1;
 146         } while (skip);
 147         return ret;
 148 }
 149
 150 static void group_smpl(mplp_pileup_t *m, bam_sample_t *sm, kstring_t *buf,
 151                                            int n, char *const*fn, int *n_plp, const bam_pileup1_t **plp, int ignore_rg)
 152 {
 153         int i, j;
 154         memset(m->n_plp, 0, m->n * sizeof(int));
 155         for (i = 0; i < n; ++i) {
 156                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 157                         const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 158                         uint8_t *q;
 159                         int id = -1;
 160                         q = ignore_rg? 0 : bam_aux_get(p->b, "RG");
 161                         if (q) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], (char*)q+1, buf);
 162                         if (id < 0) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], 0, buf);
 163                         if (id < 0 || id >= m->n) {
 164                                 assert(q); // otherwise a bug
 165                                 fprintf(stderr, "[%s] Read group %s used in file %s but absent from the header or an alignment missing read group.\n", __func__, (char*)q+1, fn[i]);
 166                                 exit(1);
 167                         }
 168                         if (m->n_plp[id] == m->m_plp[id]) {
 169                                 m->m_plp[id] = m->m_plp[id]? m->m_plp[id]<<1 : 8;
 170                                 m->plp[id] = realloc(m->plp[id], sizeof(bam_pileup1_t) * m->m_plp[id]);
 171                         }
 172                         m->plp[id][m->n_plp[id]++] = *p;
 173                 }
 174         }
 175 }
 176
 177 static int mpileup(mplp_conf_t *conf, int n, char **fn)
 178 {
 179         extern void *bcf_call_add_rg(void *rghash, const char *hdtext, const char *list);
 180         extern void bcf_call_del_rghash(void *rghash);
 181         mplp_aux_t **data;
 182         int i, tid, pos, *n_plp, tid0 = -1, beg0 = 0, end0 = 1u<<29, ref_len, ref_tid = -1, max_depth, max_indel_depth;
 183         const bam_pileup1_t **plp;
 184         bam_mplp_t iter;
 185         bam_header_t *h = 0;
 186         char *ref;
 187         void *rghash = 0;
 188
 189         bcf_callaux_t *bca = 0;
 190         bcf_callret1_t *bcr = 0;
 191         bcf_call_t bc;
 192         bcf_t *bp = 0;
 193         bcf_hdr_t *bh = 0;
 194
 195         bam_sample_t *sm = 0;
 196         kstring_t buf;
 197         mplp_pileup_t gplp;
 198
 199         memset(&gplp, 0, sizeof(mplp_pileup_t));
 200         memset(&buf, 0, sizeof(kstring_t));
 201         memset(&bc, 0, sizeof(bcf_call_t));
 202         data = calloc(n, sizeof(void*));
 203         plp = calloc(n, sizeof(void*));
 204         n_plp = calloc(n, sizeof(int*));
 205         sm = bam_smpl_init();
 206
 207         // read the header and initialize data
 208         for (i = 0; i < n; ++i) {
 209                 bam_header_t *h_tmp;
 210                 data[i] = calloc(1, sizeof(mplp_aux_t));
 211                 data[i]->fp = strcmp(fn[i], "-") == 0? bam_dopen(fileno(stdin), "r") : bam_open(fn[i], "r");
 212                 data[i]->conf = conf;
 213                 h_tmp = bam_header_read(data[i]->fp);
 214                 data[i]->h = i? h : h_tmp; // for i==0, "h" has not been set yet
 215                 bam_smpl_add(sm, fn[i], (conf->flag&MPLP_IGNORE_RG)? 0 : h_tmp->text);
 216                 rghash = bcf_call_add_rg(rghash, h_tmp->text, conf->pl_list);
 217                 if (conf->reg) {
 218                         int beg, end;
 219                         bam_index_t *idx;
 220                         idx = bam_index_load(fn[i]);
 221                         if (idx == 0) {
 222                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to load index for %d-th input.\n", __func__, i+1);
 223                                 exit(1);
 224                         }
 225                         if (bam_parse_region(h_tmp, conf->reg, &tid, &beg, &end) < 0) {
 226                                 fprintf(stderr, "[%s] malformatted region or wrong seqname for %d-th input.\n", __func__, i+1);
 227                                 exit(1);
 228                         }
 229                         if (i == 0) tid0 = tid, beg0 = beg, end0 = end;
 230                         data[i]->iter = bam_iter_query(idx, tid, beg, end);
 231                         bam_index_destroy(idx);
 232                 }
 233                 if (i == 0) h = h_tmp;
 234                 else {
 235                         // FIXME: to check consistency
 236                         bam_header_destroy(h_tmp);
 237                 }
 238         }
 239         gplp.n = sm->n;
 240         gplp.n_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 241         gplp.m_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 242         gplp.plp = calloc(sm->n, sizeof(void*));
 243
 244         fprintf(stderr, "[%s] %d samples in %d input files\n", __func__, sm->n, n);
 245         // write the VCF header
 246         if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 247                 kstring_t s;
 248                 bh = calloc(1, sizeof(bcf_hdr_t));
 249                 s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 250                 bp = bcf_open("-", (conf->flag&MPLP_NO_COMP)? "wu" : "w");
 251                 for (i = 0; i < h->n_targets; ++i) {
 252                         kputs(h->target_name[i], &s);
 253                         kputc('\0', &s);
 254                 }
 255                 bh->l_nm = s.l;
 256                 bh->name = malloc(s.l);
 257                 memcpy(bh->name, s.s, s.l);
 258                 s.l = 0;
 259                 for (i = 0; i < sm->n; ++i) {
 260                         kputs(sm->smpl[i], &s); kputc('\0', &s);
 261                 }
 262                 bh->l_smpl = s.l;
 263                 bh->sname = malloc(s.l);
 264                 memcpy(bh->sname, s.s, s.l);
 265                 bh->txt = malloc(strlen(BAM_VERSION) + 64);
 266                 bh->l_txt = 1 + sprintf(bh->txt, "##samtoolsVersion=%s\n", BAM_VERSION);
 267                 free(s.s);
 268                 bcf_hdr_sync(bh);
 269                 bcf_hdr_write(bp, bh);
 270                 bca = bcf_call_init(-1., conf->min_baseQ);
 271                 bcr = calloc(sm->n, sizeof(bcf_callret1_t));
 272                 bca->rghash = rghash;
 273                 bca->openQ = conf->openQ, bca->extQ = conf->extQ, bca->tandemQ = conf->tandemQ;
 274                 bca->min_frac = conf->min_frac;
 275                 bca->min_support = conf->min_support;
 276         }
 277         if (tid0 >= 0 && conf->fai) { // region is set
 278                 ref = faidx_fetch_seq(conf->fai, h->target_name[tid0], 0, 0x7fffffff, &ref_len);
 279                 ref_tid = tid0;
 280                 for (i = 0; i < n; ++i) data[i]->ref = ref, data[i]->ref_id = tid0;
 281         } else ref_tid = -1, ref = 0;
 282         iter = bam_mplp_init(n, mplp_func, (void**)data);
 283         max_depth = conf->max_depth;
 284         if (max_depth * sm->n > 1<<20)
 285                 fprintf(stderr, "(%s) Max depth is above 1M. Potential memory hog!\n", __func__);
 286         if (max_depth * sm->n < 8000) {
 287                 max_depth = 8000 / sm->n;
 288                 fprintf(stderr, "<%s> Set max per-file depth to %d\n", __func__, max_depth);
 289         }
 290         max_indel_depth = conf->max_indel_depth * sm->n;
 291         bam_mplp_set_maxcnt(iter, max_depth);
 292         while (bam_mplp_auto(iter, &tid, &pos, n_plp, plp) > 0) {
 293                 if (conf->reg && (pos < beg0 || pos >= end0)) continue; // out of the region requested
 294                 if (conf->bed && tid >= 0 && !bed_overlap(conf->bed, h->target_name[tid], pos, pos+1)) continue;
 295                 if (tid != ref_tid) {
 296                         free(ref); ref = 0;
 297                         if (conf->fai) ref = faidx_fetch_seq(conf->fai, h->target_name[tid], 0, 0x7fffffff, &ref_len);
 298                         for (i = 0; i < n; ++i) data[i]->ref = ref, data[i]->ref_id = tid;
 299                         ref_tid = tid;
 300                 }
 301                 if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 302                         int total_depth, _ref0, ref16;
 303                         bcf1_t *b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 304                         for (i = total_depth = 0; i < n; ++i) total_depth += n_plp[i];
 305                         group_smpl(&gplp, sm, &buf, n, fn, n_plp, plp, conf->flag & MPLP_IGNORE_RG);
 306                         _ref0 = (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N';
 307                         ref16 = bam_nt16_table[_ref0];
 308                         for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 309                                 bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], ref16, bca, bcr + i);
 310                         bcf_call_combine(gplp.n, bcr, ref16, &bc);
 311                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b, (conf->flag&(MPLP_FMT_DP|MPLP_FMT_SP))? bcr : 0,
 312                                                  (conf->flag&MPLP_FMT_SP), 0, 0);
 313                         bcf_write(bp, bh, b);
 314                         bcf_destroy(b);
 315                         // call indels
 316                         if (!(conf->flag&MPLP_NO_INDEL) && total_depth < max_indel_depth && bcf_call_gap_prep(gplp.n, gplp.n_plp, gplp.plp, pos, bca, ref, rghash) >= 0) {
 317                                 for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 318                                         bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], -1, bca, bcr + i);
 319                                 if (bcf_call_combine(gplp.n, bcr, -1, &bc) >= 0) {
 320                                         b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 321                                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b, (conf->flag&(MPLP_FMT_DP|MPLP_FMT_SP))? bcr : 0,
 322                                                                  (conf->flag&MPLP_FMT_SP), bca, ref);
 323                                         bcf_write(bp, bh, b);
 324                                         bcf_destroy(b);
 325                                 }
 326                         }
 327                 } else {
 328                         printf("%s\t%d\t%c", h->target_name[tid], pos + 1, (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N');
 329                         for (i = 0; i < n; ++i) {
 330                                 int j;
 331                                 printf("\t%d\t", n_plp[i]);
 332                                 if (n_plp[i] == 0) {
 333                                         printf("*\t*"); // FIXME: printf() is very slow...
 334                                         if (conf->flag & MPLP_PRINT_POS) printf("\t*");
 335                                 } else {
 336                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j)
 337                                                 pileup_seq(plp[i] + j, pos, ref_len, ref);
 338                                         putchar('\t');
 339                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 340                                                 const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 341                                                 int c = bam1_qual(p->b)[p->qpos] + 33;
 342                                                 if (c > 126) c = 126;
 343                                                 putchar(c);
 344                                         }
 345                                         if (conf->flag & MPLP_PRINT_MAPQ) {
 346                                                 putchar('\t');
 347                                                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 348                                                         int c = plp[i][j].b->core.qual + 33;
 349                                                         if (c > 126) c = 126;
 350                                                         putchar(c);
 351                                                 }
 352                                         }
 353                                         if (conf->flag & MPLP_PRINT_POS) {
 354                                                 putchar('\t');
 355                                                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 356                                                         if (j > 0) putchar(',');
 357                                                         printf("%d", plp[i][j].qpos + 1); // FIXME: printf() is very slow...
 358                                                 }
 359                                         }
 360                                 }
 361                         }
 362                         putchar('\n');
 363                 }
 364         }
 365
 366         bcf_close(bp);
 367         bam_smpl_destroy(sm); free(buf.s);
 368         for (i = 0; i < gplp.n; ++i) free(gplp.plp[i]);
 369         free(gplp.plp); free(gplp.n_plp); free(gplp.m_plp);
 370         bcf_call_del_rghash(rghash);
 371         bcf_hdr_destroy(bh); bcf_call_destroy(bca); free(bc.PL); free(bcr);
 372         bam_mplp_destroy(iter);
 373         bam_header_destroy(h);
 374         for (i = 0; i < n; ++i) {
 375                 bam_close(data[i]->fp);
 376                 if (data[i]->iter) bam_iter_destroy(data[i]->iter);
 377                 free(data[i]);
 378         }
 379         free(data); free(plp); free(ref); free(n_plp);
 380         return 0;
 381 }
 382
 383 #define MAX_PATH_LEN 1024
 384 static int read_file_list(const char *file_list,int *n,char **argv[])
 385 {
 386     char buf[MAX_PATH_LEN];
 387     int len, nfiles;
 388     char **files;
 389
 390     FILE *fh = fopen(file_list,"r");
 391     if ( !fh )
 392     {
 393         fprintf(stderr,"%s: %s\n", file_list,strerror(errno));
 394         return 1;
 395     }
 396
 397     // Speed is not an issue here, determine the number of files by reading the file twice
 398     nfiles = 0;
 399     while ( fgets(buf,MAX_PATH_LEN,fh) ) nfiles++;
 400
 401     if ( fseek(fh, 0L, SEEK_SET) )
 402     {
 403         fprintf(stderr,"%s: %s\n", file_list,strerror(errno));
 404         return 1;
 405     }
 406
 407     files = calloc(nfiles,sizeof(char*));
 408     nfiles = 0;
 409     while ( fgets(buf,MAX_PATH_LEN,fh) )
 410     {
 411         len = strlen(buf);
 412         while ( len>0 && isspace(buf[len-1]) ) len--;
 413         if ( !len ) continue;
 414
 415         files[nfiles] = malloc(sizeof(char)*(len+1));
 416         strncpy(files[nfiles],buf,len);
 417         files[nfiles][len] = 0;
 418         nfiles++;
 419     }
 420     fclose(fh);
 421     if ( !nfiles )
 422     {
 423         fprintf(stderr,"No files read from %s\n", file_list);
 424         return 1;
 425     }
 426     *argv = files;
 427     *n    = nfiles;
 428     return 0;
 429 }
 430 #undef MAX_PATH_LEN
 431
 432 int bam_mpileup(int argc, char *argv[])
 433 {
 434         int c;
 435     const char *file_list = NULL;
 436     char **fn = NULL;
 437     int nfiles = 0, use_orphan = 0;
 438         mplp_conf_t mplp;
 439         memset(&mplp, 0, sizeof(mplp_conf_t));
 440         #define MPLP_PRINT_POS 0x4000
 441         mplp.max_mq = 60;
 442         mplp.min_baseQ = 13;
 443         mplp.capQ_thres = 0;
 444         mplp.max_depth = 250; mplp.max_indel_depth = 250;
 445         mplp.openQ = 40; mplp.extQ = 20; mplp.tandemQ = 100;
 446         mplp.min_frac = 0.002; mplp.min_support = 1;
 447         mplp.flag = MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN;
 448         while ((c = getopt(argc, argv, "Agf:r:l:M:q:Q:uaRC:BDSd:L:b:P:o:e:h:Im:F:EG:6Os")) >= 0) {
 449                 switch (c) {
 450                 case 'f':
 451                         mplp.fai = fai_load(optarg);
 452                         if (mplp.fai == 0) return 1;
 453                         break;
 454                 case 'd': mplp.max_depth = atoi(optarg); break;
 455                 case 'r': mplp.reg = strdup(optarg); break;
 456                 case 'l': mplp.bed = bed_read(optarg); break;
 457                 case 'P': mplp.pl_list = strdup(optarg); break;
 458                 case 'g': mplp.flag |= MPLP_GLF; break;
 459                 case 'u': mplp.flag |= MPLP_NO_COMP | MPLP_GLF; break;
 460                 case 'a': mplp.flag |= MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN; break;
 461                 case 'B': mplp.flag &= ~MPLP_REALN; break;
 462                 case 'D': mplp.flag |= MPLP_FMT_DP; break;
 463                 case 'S': mplp.flag |= MPLP_FMT_SP; break;
 464                 case 'I': mplp.flag |= MPLP_NO_INDEL; break;
 465                 case 'E': mplp.flag |= MPLP_EXT_BAQ; break;
 466                 case '6': mplp.flag |= MPLP_ILLUMINA13; break;
 467                 case 'R': mplp.flag |= MPLP_IGNORE_RG; break;
 468                 case 's': mplp.flag |= MPLP_PRINT_MAPQ; break;
 469                 case 'O': mplp.flag |= MPLP_PRINT_POS; break;
 470                 case 'C': mplp.capQ_thres = atoi(optarg); break;
 471                 case 'M': mplp.max_mq = atoi(optarg); break;
 472                 case 'q': mplp.min_mq = atoi(optarg); break;
 473                 case 'Q': mplp.min_baseQ = atoi(optarg); break;
 474         case 'b': file_list = optarg; break;
 475                 case 'o': mplp.openQ = atoi(optarg); break;
 476                 case 'e': mplp.extQ = atoi(optarg); break;
 477                 case 'h': mplp.tandemQ = atoi(optarg); break;
 478                 case 'A': use_orphan = 1; break;
 479                 case 'F': mplp.min_frac = atof(optarg); break;
 480                 case 'm': mplp.min_support = atoi(optarg); break;
 481                 case 'L': mplp.max_indel_depth = atoi(optarg); break;
 482                 case 'G': {
 483                                 FILE *fp_rg;
 484                                 char buf[1024];
 485                                 mplp.rghash = bcf_str2id_init();
 486                                 if ((fp_rg = fopen(optarg, "r")) == 0)
 487                                         fprintf(stderr, "(%s) Fail to open file %s. Continue anyway.\n", __func__, optarg);
 488                                 while (!feof(fp_rg) && fscanf(fp_rg, "%s", buf) > 0) // this is not a good style, but forgive me...
 489                                         bcf_str2id_add(mplp.rghash, strdup(buf));
 490                                 fclose(fp_rg);
 491                         }
 492                         break;
 493                 }
 494         }
 495         if (use_orphan) mplp.flag &= ~MPLP_NO_ORPHAN;
 496         if (argc == 1) {
 497                 fprintf(stderr, "\n");
 498                 fprintf(stderr, "Usage: samtools mpileup [options] in1.bam [in2.bam [...]]\n\n");
 499                 fprintf(stderr, "Input options:\n\n");
 500                 fprintf(stderr, "       -6           assume the quality is in the Illumina-1.3+ encoding\n");
 501                 fprintf(stderr, "       -A           count anomalous read pairs\n");
 502                 fprintf(stderr, "       -B           disable BAQ computation\n");
 503                 fprintf(stderr, "       -b FILE      list of input BAM files [null]\n");
 504                 fprintf(stderr, "       -C INT       parameter for adjusting mapQ; 0 to disable [0]\n");
 505                 fprintf(stderr, "       -d INT       max per-BAM depth to avoid excessive memory usage [%d]\n", mplp.max_depth);
 506                 fprintf(stderr, "       -E           extended BAQ for higher sensitivity but lower specificity\n");
 507                 fprintf(stderr, "       -f FILE      faidx indexed reference sequence file [null]\n");
 508                 fprintf(stderr, "       -G FILE      exclude read groups listed in FILE [null]\n");
 509                 fprintf(stderr, "       -l FILE      list of positions (chr pos) or regions (BED) [null]\n");
 510                 fprintf(stderr, "       -M INT       cap mapping quality at INT [%d]\n", mplp.max_mq);
 511                 fprintf(stderr, "       -r STR       region in which pileup is generated [null]\n");
 512                 fprintf(stderr, "       -R           ignore RG tags\n");
 513                 fprintf(stderr, "       -q INT       skip alignments with mapQ smaller than INT [%d]\n", mplp.min_mq);
 514                 fprintf(stderr, "       -Q INT       skip bases with baseQ/BAQ smaller than INT [%d]\n", mplp.min_baseQ);
 515                 fprintf(stderr, "\nOutput options:\n\n");
 516                 fprintf(stderr, "       -D           output per-sample DP in BCF (require -g/-u)\n");
 517                 fprintf(stderr, "       -g           generate BCF output (genotype likelihoods)\n");
 518                 fprintf(stderr, "       -O           output base positions on reads (disabled by -g/-u)\n");
 519                 fprintf(stderr, "       -s           output mapping quality (disabled by -g/-u)\n");
 520                 fprintf(stderr, "       -S           output per-sample strand bias P-value in BCF (require -g/-u)\n");
 521                 fprintf(stderr, "       -u           generate uncompress BCF output\n");
 522                 fprintf(stderr, "\nSNP/INDEL genotype likelihoods options (effective with `-g' or `-u'):\n\n");
 523                 fprintf(stderr, "       -e INT       Phred-scaled gap extension seq error probability [%d]\n", mplp.extQ);
 524                 fprintf(stderr, "       -F FLOAT     minimum fraction of gapped reads for candidates [%g]\n", mplp.min_frac);
 525                 fprintf(stderr, "       -h INT       coefficient for homopolymer errors [%d]\n", mplp.tandemQ);
 526                 fprintf(stderr, "       -I           do not perform indel calling\n");
 527                 fprintf(stderr, "       -L INT       max per-sample depth for INDEL calling [%d]\n", mplp.max_indel_depth);
 528                 fprintf(stderr, "       -m INT       minimum gapped reads for indel candidates [%d]\n", mplp.min_support);
 529                 fprintf(stderr, "       -o INT       Phred-scaled gap open sequencing error probability [%d]\n", mplp.openQ);
 530                 fprintf(stderr, "       -P STR       comma separated list of platforms for indels [all]\n");
 531                 fprintf(stderr, "\n");
 532                 fprintf(stderr, "Notes: Assuming diploid individuals.\n\n");
 533                 return 1;
 534         }
 535     if (file_list) {
 536         if ( read_file_list(file_list,&nfiles,&fn) ) return 1;
 537         mpileup(&mplp,nfiles,fn);
 538         for (c=0; c<nfiles; c++) free(fn[c]);
 539         free(fn);
 540     } else mpileup(&mplp, argc - optind, argv + optind);
 541         if (mplp.rghash) bcf_str2id_thorough_destroy(mplp.rghash);
 542         free(mplp.reg); free(mplp.pl_list);
 543         if (mplp.fai) fai_destroy(mplp.fai);
 544         if (mplp.bed) bed_destroy(mplp.bed);
 545         return 0;
 546 }