bam_plcmd.c

   1 #include <math.h>
   2 #include <stdio.h>
   3 #include <unistd.h>
   4 #include <ctype.h>
   5 #include "sam.h"
   6 #include "faidx.h"
   7 #include "bam_maqcns.h"
   8 #include "khash.h"
   9 #include "glf.h"
  10 #include "kstring.h"
  11
  12 typedef int *indel_list_t;
  13 KHASH_MAP_INIT_INT64(64, indel_list_t)
  14
  15 #define BAM_PLF_SIMPLE     0x01
  16 #define BAM_PLF_CNS        0x02
  17 #define BAM_PLF_INDEL_ONLY 0x04
  18 #define BAM_PLF_GLF        0x08
  19 #define BAM_PLF_VAR_ONLY   0x10
  20 #define BAM_PLF_2ND        0x20
  21 #define BAM_PLF_RANBASE    0x40
  22 #define BAM_PLF_1STBASE    0x80
  23 #define BAM_PLF_ALLBASE    0x100
  24 #define BAM_PLF_READPOS    0x200
  25 #define BAM_PLF_NOBAQ      0x400
  26
  27 typedef struct {
  28         bam_header_t *h;
  29         bam_maqcns_t *c;
  30         bam_maqindel_opt_t *ido;
  31         faidx_t *fai;
  32         khash_t(64) *hash;
  33         uint32_t format;
  34         int tid, len, last_pos;
  35         int mask;
  36         int capQ_thres, min_baseQ;
  37     int max_depth;  // for indel calling, ignore reads with the depth too high. 0 for unlimited
  38         char *ref;
  39         glfFile fp_glf; // for glf output only
  40 } pu_data_t;
  41
  42 char **__bam_get_lines(const char *fn, int *_n);
  43 void bam_init_header_hash(bam_header_t *header);
  44 int32_t bam_get_tid(const bam_header_t *header, const char *seq_name);
  45
  46 static khash_t(64) *load_pos(const char *fn, bam_header_t *h)
  47 {
  48         char **list;
  49         int i, j, n, *fields, max_fields;
  50         khash_t(64) *hash;
  51         bam_init_header_hash(h);
  52         list = __bam_get_lines(fn, &n);
  53         hash = kh_init(64);
  54         max_fields = 0; fields = 0;
  55         for (i = 0; i < n; ++i) {
  56                 char *str = list[i];
  57                 int chr, n_fields, ret;
  58                 khint_t k;
  59                 uint64_t x;
  60                 n_fields = ksplit_core(str, 0, &max_fields, &fields);
  61                 if (n_fields < 2) continue;
  62                 chr = bam_get_tid(h, str + fields[0]);
  63                 if (chr < 0) {
  64                         fprintf(stderr, "[load_pos] unknown reference sequence name: %s\n", str + fields[0]);
  65                         continue;
  66                 }
  67                 x = (uint64_t)chr << 32 | (atoi(str + fields[1]) - 1);
  68                 k = kh_put(64, hash, x, &ret);
  69                 if (ret == 0) {
  70                         fprintf(stderr, "[load_pos] position %s:%s has been loaded.\n", str+fields[0], str+fields[1]);
  71                         continue;
  72                 }
  73                 kh_val(hash, k) = 0;
  74                 if (n_fields > 2) {
  75                         // count
  76                         for (j = 2; j < n_fields; ++j) {
  77                                 char *s = str + fields[j];
  78                                 if ((*s != '+' && *s != '-') || !isdigit(s[1])) break;
  79                         }
  80                         if (j > 2) { // update kh_val()
  81                                 int *q, y, z;
  82                                 q = kh_val(hash, k) = (int*)calloc(j - 1, sizeof(int));
  83                                 q[0] = j - 2; z = j; y = 1;
  84                                 for (j = 2; j < z; ++j)
  85                                         q[y++] = atoi(str + fields[j]);
  86                         }
  87                 }
  88                 free(str);
  89         }
  90         free(list); free(fields);
  91         return hash;
  92 }
  93
  94 static inline int printw(int c, FILE *fp)
  95 {
  96         char buf[16];
  97         int l, x;
  98         if (c == 0) return fputc('0', fp);
  99         for (l = 0, x = c < 0? -c : c; x > 0; x /= 10) buf[l++] = x%10 + '0';
 100         if (c < 0) buf[l++] = '-';
 101         buf[l] = 0;
 102         for (x = 0; x < l/2; ++x) {
 103                 int y = buf[x]; buf[x] = buf[l-1-x]; buf[l-1-x] = y;
 104         }
 105         fputs(buf, fp);
 106         return 0;
 107 }
 108
 109 // an analogy to pileup_func() below
 110 static int glt3_func(uint32_t tid, uint32_t pos, int n, const bam_pileup1_t *pu, void *data)
 111 {
 112         pu_data_t *d = (pu_data_t*)data;
 113         bam_maqindel_ret_t *r = 0;
 114         int rb, *proposed_indels = 0;
 115         glf1_t *g;
 116         glf3_t *g3;
 117
 118         if (d->fai == 0) {
 119                 fprintf(stderr, "[glt3_func] reference sequence is required for generating GLT. Abort!\n");
 120                 exit(1);
 121         }
 122         if (d->hash) { // only output a list of sites
 123                 khint_t k = kh_get(64, d->hash, (uint64_t)tid<<32|pos);
 124                 if (k == kh_end(d->hash)) return 0;
 125                 proposed_indels = kh_val(d->hash, k);
 126         }
 127         g3 = glf3_init1();
 128         if (d->fai && (int)tid != d->tid) {
 129                 if (d->ref) { // then write the end mark
 130                         g3->rtype = GLF3_RTYPE_END;
 131                         glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 132                 }
 133                 glf3_ref_write(d->fp_glf, d->h->target_name[tid], d->h->target_len[tid]); // write reference
 134                 free(d->ref);
 135                 d->ref = fai_fetch(d->fai, d->h->target_name[tid], &d->len);
 136                 d->tid = tid;
 137                 d->last_pos = 0;
 138         }
 139         rb = (d->ref && (int)pos < d->len)? d->ref[pos] : 'N';
 140         g = bam_maqcns_glfgen(n, pu, bam_nt16_table[rb], d->c);
 141         memcpy(g3, g, sizeof(glf1_t));
 142         g3->rtype = GLF3_RTYPE_SUB;
 143         g3->offset = pos - d->last_pos;
 144         d->last_pos = pos;
 145         glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 146     if (pos < d->len) {
 147         int m = (!d->max_depth || d->max_depth>n) ? n : d->max_depth;
 148                 if (proposed_indels)
 149                         r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, proposed_indels[0], proposed_indels+1);
 150                 else r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, 0, 0);
 151         }
 152         if (r) { // then write indel line
 153                 int het = 3 * n, min;
 154                 min = het;
 155                 if (min > r->gl[0]) min = r->gl[0];
 156                 if (min > r->gl[1]) min = r->gl[1];
 157                 g3->ref_base = 0;
 158                 g3->rtype = GLF3_RTYPE_INDEL;
 159                 memset(g3->lk, 0, 10);
 160                 g3->lk[0] = r->gl[0] - min < 255? r->gl[0] - min : 255;
 161                 g3->lk[1] = r->gl[1] - min < 255? r->gl[1] - min : 255;
 162                 g3->lk[2] = het - min < 255? het - min : 255;
 163                 g3->offset = 0;
 164                 g3->indel_len[0] = r->indel1;
 165                 g3->indel_len[1] = r->indel2;
 166                 g3->min_lk = min < 255? min : 255;
 167                 g3->max_len = (abs(r->indel1) > abs(r->indel2)? abs(r->indel1) : abs(r->indel2)) + 1;
 168                 g3->indel_seq[0] = strdup(r->s[0]+1);
 169                 g3->indel_seq[1] = strdup(r->s[1]+1);
 170                 glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 171                 bam_maqindel_ret_destroy(r);
 172         }
 173         free(g);
 174         glf3_destroy1(g3);
 175         return 0;
 176 }
 177
 178 static inline void pileup_seq(const bam_pileup1_t *p, int pos, int ref_len, const char *ref)
 179 {
 180         int j;
 181         if (p->is_head) {
 182                 putchar('^');
 183                 putchar(p->b->core.qual > 93? 126 : p->b->core.qual + 33);
 184         }
 185         if (!p->is_del) {
 186                 int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos)];
 187                 if (ref) {
 188                         int rb = pos < ref_len? ref[pos] : 'N';
 189                         if (c == '=' || bam_nt16_table[c] == bam_nt16_table[rb]) c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
 190                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
 191                 } else {
 192                         if (c == '=') c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
 193                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
 194                 }
 195                 putchar(c);
 196         } else putchar(p->is_refskip? (bam1_strand(p->b)? '<' : '>') : '*');
 197         if (p->indel > 0) {
 198                 putchar('+'); printw(p->indel, stdout);
 199                 for (j = 1; j <= p->indel; ++j) {
 200                         int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos + j)];
 201                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
 202                 }
 203         } else if (p->indel < 0) {
 204                 printw(p->indel, stdout);
 205                 for (j = 1; j <= -p->indel; ++j) {
 206                         int c = (ref && (int)pos+j < ref_len)? ref[pos+j] : 'N';
 207                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
 208                 }
 209         }
 210         if (p->is_tail) putchar('$');
 211 }
 212
 213 static int pileup_func(uint32_t tid, uint32_t pos, int n, const bam_pileup1_t *pu, void *data)
 214 {
 215         pu_data_t *d = (pu_data_t*)data;
 216         bam_maqindel_ret_t *r = 0;
 217         int i, rb, rms_mapq = -1, *proposed_indels = 0;
 218         uint64_t rms_aux;
 219         uint32_t cns = 0;
 220
 221         // if GLF is required, suppress -c completely
 222         if (d->format & BAM_PLF_GLF) return glt3_func(tid, pos, n, pu, data);
 223         // if d->hash is initialized, only output the sites in the hash table
 224         if (d->hash) {
 225                 khint_t k = kh_get(64, d->hash, (uint64_t)tid<<32|pos);
 226                 if (k == kh_end(d->hash)) return 0;
 227                 proposed_indels = kh_val(d->hash, k);
 228         }
 229         // update d->ref if necessary
 230         if (d->fai && (int)tid != d->tid) {
 231                 free(d->ref);
 232                 d->ref = faidx_fetch_seq(d->fai, d->h->target_name[tid], 0, 0x7fffffff, &d->len);
 233                 d->tid = tid;
 234         }
 235         rb = (d->ref && (int)pos < d->len)? d->ref[pos] : 'N';
 236         // when the indel-only mode is asked for, return if no reads mapped with indels
 237         if (d->format & BAM_PLF_INDEL_ONLY) {
 238                 for (i = 0; i < n; ++i)
 239                         if (pu[i].indel != 0) break;
 240                 if (i == n) return 0;
 241         }
 242         // call the consensus and indel
 243         if (d->format & BAM_PLF_CNS) { // call consensus
 244                 if (d->format & (BAM_PLF_RANBASE|BAM_PLF_1STBASE)) { // use a random base or the 1st base as the consensus call
 245                         const bam_pileup1_t *p = (d->format & BAM_PLF_1STBASE)? pu : pu + (int)(drand48() * n);
 246                         int q = bam1_qual(p->b)[p->qpos];
 247                         int mapQ = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 248                         uint32_t b = bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos);
 249                         cns = b<<28 | 0xf<<24 | mapQ<<16 | q<<8;
 250                 } else if (d->format & BAM_PLF_ALLBASE) { // collapse all bases
 251                         uint64_t rmsQ = 0;
 252                         uint32_t b = 0;
 253                         for (i = 0; i < n; ++i) {
 254                                 const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 255                                 int q = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 256                                 b |= bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos);
 257                                 rmsQ += q * q;
 258                         }
 259                         rmsQ = (uint64_t)(sqrt((double)rmsQ / n) + .499);
 260                         cns = b<<28 | 0xf<<24 | rmsQ<<16 | 60<<8;
 261                 } else {
 262                         glf1_t *g = bam_maqcns_glfgen(n, pu, bam_nt16_table[rb], d->c);
 263                         cns = g->depth == 0? (0xfu<<28 | 0xf<<24) : glf2cns(g, (int)(d->c->q_r + .499));
 264                         free(g);
 265                 }
 266         }
 267     if ((d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_INDEL_ONLY)) && d->ref && pos < d->len) { // call indels
 268         int m = (!d->max_depth || d->max_depth>n) ? n : d->max_depth;
 269         if (proposed_indels) // the first element gives the size of the array
 270             r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, proposed_indels[0], proposed_indels+1);
 271         else r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, 0, 0);
 272         }
 273         // when only variant sites are asked for, test if the site is a variant
 274         if ((d->format & BAM_PLF_CNS) && (d->format & BAM_PLF_VAR_ONLY)) {
 275                 if (!(bam_nt16_table[rb] != 15 && cns>>28 != 15 && cns>>28 != bam_nt16_table[rb])) { // not a SNP
 276                         if (!(r && (r->gt == 2 || strcmp(r->s[r->gt], "*")))) { // not an indel
 277                                 if (r) bam_maqindel_ret_destroy(r);
 278                                 return 0;
 279                         }
 280                 }
 281         }
 282         // print the first 3 columns
 283         fputs(d->h->target_name[tid], stdout); putchar('\t');
 284         printw(pos+1, stdout); putchar('\t'); putchar(rb); putchar('\t');
 285         // print consensus information if required
 286         if (d->format & BAM_PLF_CNS) {
 287                 putchar(bam_nt16_rev_table[cns>>28]); putchar('\t');
 288                 printw(cns>>8&0xff, stdout); putchar('\t');
 289                 printw(cns&0xff, stdout); putchar('\t');
 290                 printw(cns>>16&0xff, stdout); putchar('\t');
 291         }
 292         // print pileup sequences
 293         printw(n, stdout); putchar('\t');
 294         for (i = 0; i < n; ++i)
 295                 pileup_seq(pu + i, pos, d->len, d->ref);
 296         // finalize rms_mapq
 297         if (d->format & BAM_PLF_CNS) {
 298                 for (i = rms_aux = 0; i < n; ++i) {
 299                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 300                         int tmp = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 301                         rms_aux += tmp * tmp;
 302                 }
 303                 rms_aux = (uint64_t)(sqrt((double)rms_aux / n) + .499);
 304                 if (rms_mapq < 0) rms_mapq = rms_aux;
 305         }
 306         putchar('\t');
 307         // print quality
 308         for (i = 0; i < n; ++i) {
 309                 const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 310                 int c = bam1_qual(p->b)[p->qpos] + 33;
 311                 if (c > 126) c = 126;
 312                 putchar(c);
 313         }
 314         if (d->format & BAM_PLF_2ND) { // print 2nd calls and qualities
 315                 const unsigned char *q;
 316                 putchar('\t');
 317                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 318                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 319                         q = bam_aux_get(p->b, "E2");
 320                         putchar(q? q[p->qpos + 1] : 'N');
 321                 }
 322                 putchar('\t');
 323                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 324                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 325                         q = bam_aux_get(p->b, "U2");
 326                         putchar(q? q[p->qpos + 1] : '!');
 327                 }
 328         }
 329         // print mapping quality if -s is flagged on the command line
 330         if (d->format & BAM_PLF_SIMPLE) {
 331                 putchar('\t');
 332                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 333                         int c = pu[i].b->core.qual + 33;
 334                         if (c > 126) c = 126;
 335                         putchar(c);
 336                 }
 337         }
 338         // print read position
 339         if (d->format & BAM_PLF_READPOS) {
 340                 putchar('\t');
 341                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 342                         int x = pu[i].qpos;
 343                         int l = pu[i].b->core.l_qseq;
 344                         printw(x < l/2? x+1 : -((l-1)-x+1), stdout); putchar(',');
 345                 }
 346         }
 347         putchar('\n');
 348         // print the indel line if r has been calculated. This only happens if:
 349         // a) -c or -i are flagged, AND b) the reference sequence is available
 350         if (r) {
 351                 printf("%s\t%d\t*\t", d->h->target_name[tid], pos + 1);
 352                 if (r->gt < 2) printf("%s/%s\t", r->s[r->gt], r->s[r->gt]);
 353                 else printf("%s/%s\t", r->s[0], r->s[1]);
 354                 printf("%d\t%d\t", r->q_cns, r->q_ref);
 355                 printf("%d\t%d\t", rms_mapq, n);
 356                 printf("%s\t%s\t", r->s[0], r->s[1]);
 357                 //printf("%d\t%d\t", r->gl[0], r->gl[1]);
 358                 printf("%d\t%d\t%d\t", r->cnt1, r->cnt2, r->cnt_anti);
 359                 printf("%d\t%d\n", r->cnt_ref, r->cnt_ambi);
 360                 bam_maqindel_ret_destroy(r);
 361         }
 362         return 0;
 363 }
 364
 365 int bam_pileup(int argc, char *argv[])
 366 {
 367         int c, is_SAM = 0;
 368         char *fn_list = 0, *fn_fa = 0, *fn_pos = 0;
 369         pu_data_t *d = (pu_data_t*)calloc(1, sizeof(pu_data_t));
 370     d->max_depth = 1024; d->tid = -1; d->mask = BAM_DEF_MASK; d->min_baseQ = 13;
 371         d->c = bam_maqcns_init();
 372         d->c->errmod = BAM_ERRMOD_MAQ2; // change the default model
 373         d->ido = bam_maqindel_opt_init();
 374         while ((c = getopt(argc, argv, "st:f:cT:N:r:l:d:im:gI:G:vM:S2aR:PAQ:C:B")) >= 0) {
 375                 switch (c) {
 376                 case 'Q': d->c->min_baseQ = atoi(optarg); break;
 377                 case 'C': d->capQ_thres = atoi(optarg); break;
 378                 case 'B': d->format |= BAM_PLF_NOBAQ; break;
 379                 case 'a': d->c->errmod = BAM_ERRMOD_SOAP; break;
 380                 case 'A': d->c->errmod = BAM_ERRMOD_MAQ; break;
 381                 case 's': d->format |= BAM_PLF_SIMPLE; break;
 382                 case 't': fn_list = strdup(optarg); break;
 383                 case 'l': fn_pos = strdup(optarg); break;
 384                 case 'f': fn_fa = strdup(optarg); break;
 385                 case 'T': d->c->theta = atof(optarg); break;
 386                 case 'N': d->c->n_hap = atoi(optarg); break;
 387                 case 'r': d->c->het_rate = atof(optarg); d->ido->r_snp = d->c->het_rate; break;
 388                 case 'M': d->c->cap_mapQ = atoi(optarg); break;
 389                 case 'd': d->max_depth = atoi(optarg); break;
 390                 case 'c': d->format |= BAM_PLF_CNS; break;
 391                 case 'i': d->format |= BAM_PLF_INDEL_ONLY; break;
 392                 case 'v': d->format |= BAM_PLF_VAR_ONLY; break;
 393                 case 'm': d->mask = strtol(optarg, 0, 0); break;
 394                 case 'g': d->format |= BAM_PLF_GLF; break;
 395                 case '2': d->format |= BAM_PLF_2ND; break;
 396                 case 'P': d->format |= BAM_PLF_READPOS; break;
 397                 case 'I': d->ido->q_indel = atoi(optarg); break;
 398                 case 'G': d->ido->r_indel = atof(optarg); break;
 399                 case 'S': is_SAM = 1; break;
 400                 case 'R':
 401                         if (strcmp(optarg, "random") == 0) d->format |= BAM_PLF_RANBASE;
 402                         else if (strcmp(optarg, "first") == 0) d->format |= BAM_PLF_1STBASE;
 403                         else if (strcmp(optarg, "all") == 0) d->format |= BAM_PLF_ALLBASE;
 404                         else fprintf(stderr, "[bam_pileup] unrecognized -R\n");
 405                         break;
 406                 default: fprintf(stderr, "Unrecognizd option '-%c'.\n", c); return 1;
 407                 }
 408         }
 409         if (d->c->errmod != BAM_ERRMOD_MAQ2) d->c->theta += 0.02;
 410         if (d->c->theta > 1.0) d->c->theta = 1.0;
 411         if (fn_list) is_SAM = 1;
 412         if (optind == argc) {
 413                 fprintf(stderr, "\n");
 414                 fprintf(stderr, "Usage:  samtools pileup [options] <in.bam>|<in.sam>\n\n");
 415                 fprintf(stderr, "Option: -s        simple (yet incomplete) pileup format\n");
 416                 fprintf(stderr, "        -S        the input is in SAM\n");
 417                 fprintf(stderr, "        -B        disable BAQ computation\n");
 418                 fprintf(stderr, "        -A        use the original MAQ model for SNP calling (DEPRECATED)\n");
 419                 fprintf(stderr, "        -2        output the 2nd best call and quality\n");
 420                 fprintf(stderr, "        -i        only show lines/consensus with indels\n");
 421                 fprintf(stderr, "        -Q INT    min base quality (possibly capped by BAQ) [%d]\n", d->c->min_baseQ);
 422                 fprintf(stderr, "        -C INT    coefficient for adjusting mapQ of poor mappings [%d]\n", d->capQ_thres);
 423                 fprintf(stderr, "        -m INT    filtering reads with bits in INT [0x%x]\n", d->mask);
 424                 fprintf(stderr, "        -M INT    cap mapping quality at INT [%d]\n", d->c->cap_mapQ);
 425         fprintf(stderr, "        -d INT    limit maximum depth for indels [%d]\n", d->max_depth);
 426                 fprintf(stderr, "        -t FILE   list of reference sequences (force -S)\n");
 427                 fprintf(stderr, "        -l FILE   list of sites at which pileup is output\n");
 428                 fprintf(stderr, "        -f FILE   reference sequence in the FASTA format\n\n");
 429                 fprintf(stderr, "        -c        compute the consensus sequence\n");
 430                 fprintf(stderr, "        -v        print variants only (for -c)\n");
 431                 fprintf(stderr, "        -g        output in the GLFv3 format (DEPRECATED)\n");
 432                 fprintf(stderr, "        -T FLOAT  theta in maq consensus calling model (for -c) [%.4g]\n", d->c->theta);
 433                 fprintf(stderr, "        -N INT    number of haplotypes in the sample (for -c) [%d]\n", d->c->n_hap);
 434                 fprintf(stderr, "        -r FLOAT  prior of a difference between two haplotypes (for -c) [%.4g]\n", d->c->het_rate);
 435                 fprintf(stderr, "        -G FLOAT  prior of an indel between two haplotypes (for -c) [%.4g]\n", d->ido->r_indel);
 436                 fprintf(stderr, "        -I INT    phred prob. of an indel in sequencing/prep. (for -c) [%d]\n", d->ido->q_indel);
 437                 fprintf(stderr, "\n");
 438                 free(fn_list); free(fn_fa); free(d);
 439                 return 1;
 440         }
 441         if (d->format & (BAM_PLF_RANBASE|BAM_PLF_1STBASE|BAM_PLF_ALLBASE)) d->format |= BAM_PLF_CNS;
 442         if (fn_fa) d->fai = fai_load(fn_fa);
 443         if (d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_GLF)) bam_maqcns_prepare(d->c); // consensus calling
 444         if (d->format & BAM_PLF_GLF) { // for glf output
 445                 glf3_header_t *h;
 446                 h = glf3_header_init();
 447                 d->fp_glf = bgzf_fdopen(fileno(stdout), "w");
 448                 glf3_header_write(d->fp_glf, h);
 449                 glf3_header_destroy(h);
 450         }
 451         if (d->fai == 0 && (d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_INDEL_ONLY)))
 452                 fprintf(stderr, "[bam_pileup] indels will not be called when -f is absent.\n");
 453         if (fn_fa && is_SAM && fn_list == 0) fn_list = samfaipath(fn_fa);
 454
 455         {
 456                 samfile_t *fp;
 457                 fp = is_SAM? samopen(argv[optind], "r", fn_list) : samopen(argv[optind], "rb", 0);
 458                 if (fp == 0 || fp->header == 0) {
 459                         fprintf(stderr, "[bam_pileup] fail to read the header: non-exisiting file or wrong format.\n");
 460                         return 1;
 461                 }
 462                 d->h = fp->header;
 463                 if (fn_pos) d->hash = load_pos(fn_pos, d->h);
 464                 { // run pileup
 465                         extern int bam_prob_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 466                         extern int bam_cap_mapQ(bam1_t *b, char *ref, int thres);
 467                         bam1_t *b;
 468                         int ret, tid, pos, n_plp;
 469                         bam_plp_t iter;
 470                         const bam_pileup1_t *plp;
 471                         b = bam_init1();
 472                         iter = bam_plp_init(0, 0);
 473                         bam_plp_set_mask(iter, d->mask);
 474                         while ((ret = samread(fp, b)) >= 0) {
 475                                 int skip = 0;
 476                                 if ((int)b->core.tid < 0) break;
 477                                 // update d->ref if necessary
 478                                 if (d->fai && (int)b->core.tid != d->tid) {
 479                                         free(d->ref);
 480                                         d->ref = faidx_fetch_seq(d->fai, d->h->target_name[b->core.tid], 0, 0x7fffffff, &d->len);
 481                                         d->tid = b->core.tid;
 482                                 }
 483                                 if (d->ref && (d->format&BAM_PLF_CNS) && !(d->format&BAM_PLF_NOBAQ)) bam_prob_realn(b, d->ref);
 484                                 if (d->ref && (d->format&BAM_PLF_CNS) && d->capQ_thres > 10) {
 485                                         int q = bam_cap_mapQ(b, d->ref, d->capQ_thres);
 486                                         if (q < 0) skip = 1;
 487                                         else if (b->core.qual > q) b->core.qual = q;
 488                                 } else if (b->core.flag&BAM_FUNMAP) skip = 1;
 489                                 else if ((d->format&BAM_PLF_CNS) && (b->core.flag&1) && !(b->core.flag&2)) skip = 1;
 490                                 if (skip) continue;
 491                                 bam_plp_push(iter, b);
 492                                 while ((plp = bam_plp_next(iter, &tid, &pos, &n_plp)) != 0)
 493                                         pileup_func(tid, pos, n_plp, plp, d);
 494                         }
 495                         bam_plp_push(iter, 0);
 496                         while ((plp = bam_plp_next(iter, &tid, &pos, &n_plp)) != 0)
 497                                 pileup_func(tid, pos, n_plp, plp, d);
 498                         bam_plp_destroy(iter);
 499                         bam_destroy1(b);
 500                 }
 501                 samclose(fp); // d->h will be destroyed here
 502         }
 503
 504         // free
 505         if (d->format & BAM_PLF_GLF) bgzf_close(d->fp_glf);
 506         if (fn_pos) { // free the hash table
 507                 khint_t k;
 508                 for (k = kh_begin(d->hash); k < kh_end(d->hash); ++k)
 509                         if (kh_exist(d->hash, k)) free(kh_val(d->hash, k));
 510                 kh_destroy(64, d->hash);
 511         }
 512         free(fn_pos); free(fn_list); free(fn_fa);
 513         if (d->fai) fai_destroy(d->fai);
 514         bam_maqcns_destroy(d->c);
 515         free(d->ido); free(d->ref); free(d);
 516         return 0;
 517 }
 518
 519 /***********
 520  * mpileup *
 521  ***********/
 522
 523 #include <assert.h>
 524 #include "bam2bcf.h"
 525 #include "sample.h"
 526
 527 #define MPLP_GLF   0x10
 528 #define MPLP_NO_COMP 0x20
 529 #define MPLP_NO_ORPHAN 0x40
 530 #define MPLP_REALN   0x80
 531
 532 typedef struct {
 533         int max_mq, min_mq, flag, min_baseQ, capQ_thres;
 534         char *reg, *fn_pos;
 535         faidx_t *fai;
 536         kh_64_t *hash;
 537 } mplp_conf_t;
 538
 539 typedef struct {
 540         bamFile fp;
 541         bam_iter_t iter;
 542         int min_mq, flag, ref_id, capQ_thres;
 543         char *ref;
 544 } mplp_aux_t;
 545
 546 typedef struct {
 547         int n;
 548         int *n_plp, *m_plp;
 549         bam_pileup1_t **plp;
 550 } mplp_pileup_t;
 551
 552 static int mplp_func(void *data, bam1_t *b)
 553 {
 554         extern int bam_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 555         extern int bam_prob_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 556         extern int bam_cap_mapQ(bam1_t *b, char *ref, int thres);
 557         mplp_aux_t *ma = (mplp_aux_t*)data;
 558         int ret, skip = 0;
 559         do {
 560                 int has_ref = (ma->ref && ma->ref_id == b->core.tid)? 1 : 0;
 561                 ret = ma->iter? bam_iter_read(ma->fp, ma->iter, b) : bam_read1(ma->fp, b);
 562                 if (ret < 0) break;
 563                 skip = 0;
 564                 if (has_ref && (ma->flag&MPLP_REALN)) bam_prob_realn(b, ma->ref);
 565                 if (has_ref && ma->capQ_thres > 10) {
 566                         int q = bam_cap_mapQ(b, ma->ref, ma->capQ_thres);
 567                         if (q < 0) skip = 1;
 568                         else if (b->core.qual > q) b->core.qual = q;
 569                 } else if (b->core.flag&BAM_FUNMAP) skip = 1;
 570                 else if (b->core.qual < ma->min_mq) skip = 1;
 571                 else if ((ma->flag&MPLP_NO_ORPHAN) && (b->core.flag&1) && !(b->core.flag&2)) skip = 1;
 572         } while (skip);
 573         return ret;
 574 }
 575
 576 static void group_smpl(mplp_pileup_t *m, bam_sample_t *sm, kstring_t *buf,
 577                                            int n, char *const*fn, int *n_plp, const bam_pileup1_t **plp)
 578 {
 579         int i, j;
 580         memset(m->n_plp, 0, m->n * sizeof(int));
 581         for (i = 0; i < n; ++i) {
 582                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 583                         const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 584                         uint8_t *q;
 585                         int id = -1;
 586                         q = bam_aux_get(p->b, "RG");
 587                         if (q) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], (char*)q+1, buf);
 588                         if (id < 0) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], 0, buf);
 589                         assert(id >= 0 && id < m->n);
 590                         if (m->n_plp[id] == m->m_plp[id]) {
 591                                 m->m_plp[id] = m->m_plp[id]? m->m_plp[id]<<1 : 8;
 592                                 m->plp[id] = realloc(m->plp[id], sizeof(bam_pileup1_t) * m->m_plp[id]);
 593                         }
 594                         m->plp[id][m->n_plp[id]++] = *p;
 595                 }
 596         }
 597 }
 598
 599 static int mpileup(mplp_conf_t *conf, int n, char **fn)
 600 {
 601         mplp_aux_t **data;
 602         int i, tid, pos, *n_plp, beg0 = 0, end0 = 1u<<29, ref_len, ref_tid;
 603         const bam_pileup1_t **plp;
 604         bam_mplp_t iter;
 605         bam_header_t *h = 0;
 606         char *ref;
 607         khash_t(64) *hash = 0;
 608
 609         bcf_callaux_t *bca = 0;
 610         bcf_callret1_t *bcr = 0;
 611         bcf_call_t bc;
 612         bcf_t *bp = 0;
 613         bcf_hdr_t *bh = 0;
 614
 615         bam_sample_t *sm = 0;
 616         kstring_t buf;
 617         mplp_pileup_t gplp;
 618
 619         memset(&gplp, 0, sizeof(mplp_pileup_t));
 620         memset(&buf, 0, sizeof(kstring_t));
 621         memset(&bc, 0, sizeof(bcf_call_t));
 622         data = calloc(n, sizeof(void*));
 623         plp = calloc(n, sizeof(void*));
 624         n_plp = calloc(n, sizeof(int*));
 625         sm = bam_smpl_init();
 626
 627         // read the header and initialize data
 628         for (i = 0; i < n; ++i) {
 629                 bam_header_t *h_tmp;
 630                 data[i] = calloc(1, sizeof(mplp_aux_t));
 631                 data[i]->min_mq = conf->min_mq;
 632                 data[i]->flag = conf->flag;
 633                 data[i]->capQ_thres = conf->capQ_thres;
 634                 data[i]->fp = strcmp(fn[i], "-") == 0? bam_dopen(fileno(stdin), "r") : bam_open(fn[i], "r");
 635                 h_tmp = bam_header_read(data[i]->fp);
 636                 bam_smpl_add(sm, fn[i], h_tmp->text);
 637                 if (conf->reg) {
 638                         int beg, end;
 639                         bam_index_t *idx;
 640                         idx = bam_index_load(fn[i]);
 641                         if (idx == 0) {
 642                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to load index for %d-th input.\n", __func__, i+1);
 643                                 exit(1);
 644                         }
 645                         if (bam_parse_region(h_tmp, conf->reg, &tid, &beg, &end) < 0) {
 646                                 fprintf(stderr, "[%s] malformatted region or wrong seqname for %d-th input.\n", __func__, i+1);
 647                                 exit(1);
 648                         }
 649                         if (i == 0) beg0 = beg, end0 = end;
 650                         data[i]->iter = bam_iter_query(idx, tid, beg, end);
 651                         bam_index_destroy(idx);
 652                 }
 653                 if (i == 0) h = h_tmp;
 654                 else {
 655                         // FIXME: to check consistency
 656                         bam_header_destroy(h_tmp);
 657                 }
 658         }
 659         gplp.n = sm->n;
 660         gplp.n_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 661         gplp.m_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 662         gplp.plp = calloc(sm->n, sizeof(void*));
 663
 664         fprintf(stderr, "[%s] %d samples in %d input files\n", __func__, sm->n, n);
 665         if (conf->fn_pos) hash = load_pos(conf->fn_pos, h);
 666         // write the VCF header
 667         if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 668                 kstring_t s;
 669                 bh = calloc(1, sizeof(bcf_hdr_t));
 670                 s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 671                 bp = bcf_open("-", (conf->flag&MPLP_NO_COMP)? "wu" : "w");
 672                 for (i = 0; i < h->n_targets; ++i) {
 673                         kputs(h->target_name[i], &s);
 674                         kputc('\0', &s);
 675                 }
 676                 bh->l_nm = s.l;
 677                 bh->name = malloc(s.l);
 678                 memcpy(bh->name, s.s, s.l);
 679                 s.l = 0;
 680                 for (i = 0; i < sm->n; ++i) {
 681                         kputs(sm->smpl[i], &s); kputc('\0', &s);
 682                 }
 683                 bh->l_smpl = s.l;
 684                 bh->sname = malloc(s.l);
 685                 memcpy(bh->sname, s.s, s.l);
 686                 bh->l_txt = 0;
 687                 free(s.s);
 688                 bcf_hdr_sync(bh);
 689                 bcf_hdr_write(bp, bh);
 690                 bca = bcf_call_init(-1., conf->min_baseQ);
 691                 bcr = calloc(sm->n, sizeof(bcf_callret1_t));
 692         }
 693         ref_tid = -1; ref = 0;
 694         iter = bam_mplp_init(n, mplp_func, (void**)data);
 695         while (bam_mplp_auto(iter, &tid, &pos, n_plp, plp) > 0) {
 696                 if (conf->reg && (pos < beg0 || pos >= end0)) continue; // out of the region requested
 697                 if (hash) {
 698                         khint_t k;
 699                         k = kh_get(64, hash, (uint64_t)tid<<32 | pos);
 700                         if (k == kh_end(hash)) continue;
 701                 }
 702                 if (tid != ref_tid) {
 703                         free(ref); ref = 0;
 704                         if (conf->fai) ref = fai_fetch(conf->fai, h->target_name[tid], &ref_len);
 705                         for (i = 0; i < n; ++i) data[i]->ref = ref, data[i]->ref_id = tid;
 706                         ref_tid = tid;
 707                 }
 708                 if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 709                         int _ref0, ref16;
 710                         bcf1_t *b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 711                         group_smpl(&gplp, sm, &buf, n, fn, n_plp, plp);
 712                         _ref0 = (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N';
 713                         ref16 = bam_nt16_table[_ref0];
 714                         for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 715                                 bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], ref16, bca, bcr + i);
 716                         bcf_call_combine(gplp.n, bcr, ref16, &bc);
 717                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b);
 718                         bcf_write(bp, bh, b);
 719                         bcf_destroy(b);
 720                 } else {
 721                         printf("%s\t%d\t%c", h->target_name[tid], pos + 1, (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N');
 722                         for (i = 0; i < n; ++i) {
 723                                 int j;
 724                                 printf("\t%d\t", n_plp[i]);
 725                                 if (n_plp[i] == 0) printf("*\t*");
 726                                 else {
 727                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j)
 728                                                 pileup_seq(plp[i] + j, pos, ref_len, ref);
 729                                         putchar('\t');
 730                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 731                                                 const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 732                                                 int c = bam1_qual(p->b)[p->qpos] + 33;
 733                                                 if (c > 126) c = 126;
 734                                                 putchar(c);
 735                                         }
 736                                 }
 737                         }
 738                         putchar('\n');
 739                 }
 740         }
 741
 742         bcf_close(bp);
 743         bam_smpl_destroy(sm); free(buf.s);
 744         for (i = 0; i < gplp.n; ++i) free(gplp.plp[i]);
 745         free(gplp.plp); free(gplp.n_plp); free(gplp.m_plp);
 746         if (hash) { // free the hash table
 747                 khint_t k;
 748                 for (k = kh_begin(hash); k < kh_end(hash); ++k)
 749                         if (kh_exist(hash, k)) free(kh_val(hash, k));
 750                 kh_destroy(64, hash);
 751         }
 752         bcf_hdr_destroy(bh); bcf_call_destroy(bca); free(bc.PL); free(bcr);
 753         bam_mplp_destroy(iter);
 754         bam_header_destroy(h);
 755         for (i = 0; i < n; ++i) {
 756                 bam_close(data[i]->fp);
 757                 if (data[i]->iter) bam_iter_destroy(data[i]->iter);
 758                 free(data[i]);
 759         }
 760         free(data); free(plp); free(ref); free(n_plp);
 761         return 0;
 762 }
 763
 764 int bam_mpileup(int argc, char *argv[])
 765 {
 766         int c;
 767         mplp_conf_t mplp;
 768         memset(&mplp, 0, sizeof(mplp_conf_t));
 769         mplp.max_mq = 60;
 770         mplp.min_baseQ = 13;
 771         mplp.capQ_thres = 0;
 772         mplp.flag = MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN;
 773         while ((c = getopt(argc, argv, "gf:r:l:M:q:Q:uaORC:B")) >= 0) {
 774                 switch (c) {
 775                 case 'f':
 776                         mplp.fai = fai_load(optarg);
 777                         if (mplp.fai == 0) return 1;
 778                         break;
 779                 case 'r': mplp.reg = strdup(optarg); break;
 780                 case 'l': mplp.fn_pos = strdup(optarg); break;
 781                 case 'g': mplp.flag |= MPLP_GLF; break;
 782                 case 'u': mplp.flag |= MPLP_NO_COMP | MPLP_GLF; break;
 783                 case 'a': mplp.flag |= MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN; break;
 784                 case 'B': mplp.flag &= ~MPLP_REALN & ~MPLP_NO_ORPHAN; break;
 785                 case 'O': mplp.flag |= MPLP_NO_ORPHAN; break;
 786                 case 'R': mplp.flag |= MPLP_REALN; break;
 787                 case 'C': mplp.capQ_thres = atoi(optarg); break;
 788                 case 'M': mplp.max_mq = atoi(optarg); break;
 789                 case 'q': mplp.min_mq = atoi(optarg); break;
 790                 case 'Q': mplp.min_baseQ = atoi(optarg); break;
 791                 }
 792         }
 793         if (argc == 1) {
 794                 fprintf(stderr, "\n");
 795                 fprintf(stderr, "Usage:   samtools mpileup [options] in1.bam [in2.bam [...]]\n\n");
 796                 fprintf(stderr, "Options: -f FILE     reference sequence file [null]\n");
 797                 fprintf(stderr, "         -r STR      region in which pileup is generated [null]\n");
 798                 fprintf(stderr, "         -l FILE     list of positions (format: chr pos) [null]\n");
 799                 fprintf(stderr, "         -M INT      cap mapping quality at INT [%d]\n", mplp.max_mq);
 800                 fprintf(stderr, "         -Q INT      min base quality [%d]\n", mplp.min_baseQ);
 801                 fprintf(stderr, "         -q INT      filter out alignment with MQ smaller than INT [%d]\n", mplp.min_mq);
 802                 fprintf(stderr, "         -g          generate BCF output\n");
 803                 fprintf(stderr, "         -u          do not compress BCF output\n");
 804                 fprintf(stderr, "         -B          disable BAQ computation\n");
 805                 fprintf(stderr, "\n");
 806                 fprintf(stderr, "Notes: Assuming diploid individuals.\n\n");
 807                 return 1;
 808         }
 809         mpileup(&mplp, argc - optind, argv + optind);
 810         free(mplp.reg);
 811         if (mplp.fai) fai_destroy(mplp.fai);
 812         return 0;
 813 }