bam_plcmd.c

   1 #include <math.h>
   2 #include <stdio.h>
   3 #include <unistd.h>
   4 #include <ctype.h>
   5 #include <string.h>
   6 #include <errno.h>
   7 #include "sam.h"
   8 #include "faidx.h"
   9 #include "bam_maqcns.h"
  10 #include "khash.h"
  11 #include "glf.h"
  12 #include "kstring.h"
  13
  14 typedef int *indel_list_t;
  15 KHASH_MAP_INIT_INT64(64, indel_list_t)
  16
  17 #define BAM_PLF_SIMPLE     0x01
  18 #define BAM_PLF_CNS        0x02
  19 #define BAM_PLF_INDEL_ONLY 0x04
  20 #define BAM_PLF_GLF        0x08
  21 #define BAM_PLF_VAR_ONLY   0x10
  22 #define BAM_PLF_2ND        0x20
  23 #define BAM_PLF_RANBASE    0x40
  24 #define BAM_PLF_1STBASE    0x80
  25 #define BAM_PLF_ALLBASE    0x100
  26 #define BAM_PLF_READPOS    0x200
  27 #define BAM_PLF_NOBAQ      0x400
  28
  29 typedef struct {
  30         bam_header_t *h;
  31         bam_maqcns_t *c;
  32         bam_maqindel_opt_t *ido;
  33         faidx_t *fai;
  34         khash_t(64) *hash;
  35         uint32_t format;
  36         int tid, len, last_pos;
  37         int mask;
  38         int capQ_thres, min_baseQ;
  39     int max_depth;  // for indel calling, ignore reads with the depth too high. 0 for unlimited
  40         char *ref;
  41         glfFile fp_glf; // for glf output only
  42 } pu_data_t;
  43
  44 char **__bam_get_lines(const char *fn, int *_n);
  45 void bam_init_header_hash(bam_header_t *header);
  46 int32_t bam_get_tid(const bam_header_t *header, const char *seq_name);
  47
  48 static khash_t(64) *load_pos(const char *fn, bam_header_t *h)
  49 {
  50         char **list;
  51         int i, j, n, *fields, max_fields;
  52         khash_t(64) *hash;
  53         bam_init_header_hash(h);
  54         list = __bam_get_lines(fn, &n);
  55         hash = kh_init(64);
  56         max_fields = 0; fields = 0;
  57         for (i = 0; i < n; ++i) {
  58                 char *str = list[i];
  59                 int chr, n_fields, ret;
  60                 khint_t k;
  61                 uint64_t x;
  62                 n_fields = ksplit_core(str, 0, &max_fields, &fields);
  63                 if (n_fields < 2) continue;
  64                 chr = bam_get_tid(h, str + fields[0]);
  65                 if (chr < 0) {
  66                         fprintf(stderr, "[load_pos] unknown reference sequence name: %s\n", str + fields[0]);
  67                         continue;
  68                 }
  69                 x = (uint64_t)chr << 32 | (atoi(str + fields[1]) - 1);
  70                 k = kh_put(64, hash, x, &ret);
  71                 if (ret == 0) {
  72                         fprintf(stderr, "[load_pos] position %s:%s has been loaded.\n", str+fields[0], str+fields[1]);
  73                         continue;
  74                 }
  75                 kh_val(hash, k) = 0;
  76                 if (n_fields > 2) {
  77                         // count
  78                         for (j = 2; j < n_fields; ++j) {
  79                                 char *s = str + fields[j];
  80                                 if ((*s != '+' && *s != '-') || !isdigit(s[1])) break;
  81                         }
  82                         if (j > 2) { // update kh_val()
  83                                 int *q, y, z;
  84                                 q = kh_val(hash, k) = (int*)calloc(j - 1, sizeof(int));
  85                                 q[0] = j - 2; z = j; y = 1;
  86                                 for (j = 2; j < z; ++j)
  87                                         q[y++] = atoi(str + fields[j]);
  88                         }
  89                 }
  90                 free(str);
  91         }
  92         free(list); free(fields);
  93         return hash;
  94 }
  95
  96 static inline int printw(int c, FILE *fp)
  97 {
  98         char buf[16];
  99         int l, x;
 100         if (c == 0) return fputc('0', fp);
 101         for (l = 0, x = c < 0? -c : c; x > 0; x /= 10) buf[l++] = x%10 + '0';
 102         if (c < 0) buf[l++] = '-';
 103         buf[l] = 0;
 104         for (x = 0; x < l/2; ++x) {
 105                 int y = buf[x]; buf[x] = buf[l-1-x]; buf[l-1-x] = y;
 106         }
 107         fputs(buf, fp);
 108         return 0;
 109 }
 110
 111 // an analogy to pileup_func() below
 112 static int glt3_func(uint32_t tid, uint32_t pos, int n, const bam_pileup1_t *pu, void *data)
 113 {
 114         pu_data_t *d = (pu_data_t*)data;
 115         bam_maqindel_ret_t *r = 0;
 116         int rb, *proposed_indels = 0;
 117         glf1_t *g;
 118         glf3_t *g3;
 119
 120         if (d->fai == 0) {
 121                 fprintf(stderr, "[glt3_func] reference sequence is required for generating GLT. Abort!\n");
 122                 exit(1);
 123         }
 124         if (d->hash) { // only output a list of sites
 125                 khint_t k = kh_get(64, d->hash, (uint64_t)tid<<32|pos);
 126                 if (k == kh_end(d->hash)) return 0;
 127                 proposed_indels = kh_val(d->hash, k);
 128         }
 129         g3 = glf3_init1();
 130         if (d->fai && (int)tid != d->tid) {
 131                 if (d->ref) { // then write the end mark
 132                         g3->rtype = GLF3_RTYPE_END;
 133                         glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 134                 }
 135                 glf3_ref_write(d->fp_glf, d->h->target_name[tid], d->h->target_len[tid]); // write reference
 136                 free(d->ref);
 137                 d->ref = fai_fetch(d->fai, d->h->target_name[tid], &d->len);
 138                 d->tid = tid;
 139                 d->last_pos = 0;
 140         }
 141         rb = (d->ref && (int)pos < d->len)? d->ref[pos] : 'N';
 142         g = bam_maqcns_glfgen(n, pu, bam_nt16_table[rb], d->c);
 143         memcpy(g3, g, sizeof(glf1_t));
 144         g3->rtype = GLF3_RTYPE_SUB;
 145         g3->offset = pos - d->last_pos;
 146         d->last_pos = pos;
 147         glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 148     if (pos < d->len) {
 149         int m = (!d->max_depth || d->max_depth>n) ? n : d->max_depth;
 150                 if (proposed_indels)
 151                         r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, proposed_indels[0], proposed_indels+1);
 152                 else r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, 0, 0);
 153         }
 154         if (r) { // then write indel line
 155                 int het = 3 * n, min;
 156                 min = het;
 157                 if (min > r->gl[0]) min = r->gl[0];
 158                 if (min > r->gl[1]) min = r->gl[1];
 159                 g3->ref_base = 0;
 160                 g3->rtype = GLF3_RTYPE_INDEL;
 161                 memset(g3->lk, 0, 10);
 162                 g3->lk[0] = r->gl[0] - min < 255? r->gl[0] - min : 255;
 163                 g3->lk[1] = r->gl[1] - min < 255? r->gl[1] - min : 255;
 164                 g3->lk[2] = het - min < 255? het - min : 255;
 165                 g3->offset = 0;
 166                 g3->indel_len[0] = r->indel1;
 167                 g3->indel_len[1] = r->indel2;
 168                 g3->min_lk = min < 255? min : 255;
 169                 g3->max_len = (abs(r->indel1) > abs(r->indel2)? abs(r->indel1) : abs(r->indel2)) + 1;
 170                 g3->indel_seq[0] = strdup(r->s[0]+1);
 171                 g3->indel_seq[1] = strdup(r->s[1]+1);
 172                 glf3_write1(d->fp_glf, g3);
 173                 bam_maqindel_ret_destroy(r);
 174         }
 175         free(g);
 176         glf3_destroy1(g3);
 177         return 0;
 178 }
 179
 180 static inline void pileup_seq(const bam_pileup1_t *p, int pos, int ref_len, const char *ref)
 181 {
 182         int j;
 183         if (p->is_head) {
 184                 putchar('^');
 185                 putchar(p->b->core.qual > 93? 126 : p->b->core.qual + 33);
 186         }
 187         if (!p->is_del) {
 188                 int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos)];
 189                 if (ref) {
 190                         int rb = pos < ref_len? ref[pos] : 'N';
 191                         if (c == '=' || bam_nt16_table[c] == bam_nt16_table[rb]) c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
 192                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
 193                 } else {
 194                         if (c == '=') c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
 195                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
 196                 }
 197                 putchar(c);
 198         } else putchar(p->is_refskip? (bam1_strand(p->b)? '<' : '>') : '*');
 199         if (p->indel > 0) {
 200                 putchar('+'); printw(p->indel, stdout);
 201                 for (j = 1; j <= p->indel; ++j) {
 202                         int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos + j)];
 203                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
 204                 }
 205         } else if (p->indel < 0) {
 206                 printw(p->indel, stdout);
 207                 for (j = 1; j <= -p->indel; ++j) {
 208                         int c = (ref && (int)pos+j < ref_len)? ref[pos+j] : 'N';
 209                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
 210                 }
 211         }
 212         if (p->is_tail) putchar('$');
 213 }
 214
 215 static int pileup_func(uint32_t tid, uint32_t pos, int n, const bam_pileup1_t *pu, void *data)
 216 {
 217         pu_data_t *d = (pu_data_t*)data;
 218         bam_maqindel_ret_t *r = 0;
 219         int i, rb, rms_mapq = -1, *proposed_indels = 0;
 220         uint64_t rms_aux;
 221         uint32_t cns = 0;
 222
 223         // if GLF is required, suppress -c completely
 224         if (d->format & BAM_PLF_GLF) return glt3_func(tid, pos, n, pu, data);
 225         // if d->hash is initialized, only output the sites in the hash table
 226         if (d->hash) {
 227                 khint_t k = kh_get(64, d->hash, (uint64_t)tid<<32|pos);
 228                 if (k == kh_end(d->hash)) return 0;
 229                 proposed_indels = kh_val(d->hash, k);
 230         }
 231         // update d->ref if necessary
 232         if (d->fai && (int)tid != d->tid) {
 233                 free(d->ref);
 234                 d->ref = faidx_fetch_seq(d->fai, d->h->target_name[tid], 0, 0x7fffffff, &d->len);
 235                 d->tid = tid;
 236         }
 237         rb = (d->ref && (int)pos < d->len)? d->ref[pos] : 'N';
 238         // when the indel-only mode is asked for, return if no reads mapped with indels
 239         if (d->format & BAM_PLF_INDEL_ONLY) {
 240                 for (i = 0; i < n; ++i)
 241                         if (pu[i].indel != 0) break;
 242                 if (i == n) return 0;
 243         }
 244         // call the consensus and indel
 245         if (d->format & BAM_PLF_CNS) { // call consensus
 246                 if (d->format & (BAM_PLF_RANBASE|BAM_PLF_1STBASE)) { // use a random base or the 1st base as the consensus call
 247                         const bam_pileup1_t *p = (d->format & BAM_PLF_1STBASE)? pu : pu + (int)(drand48() * n);
 248                         int q = bam1_qual(p->b)[p->qpos];
 249                         int mapQ = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 250                         uint32_t b = bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos);
 251                         cns = b<<28 | 0xf<<24 | mapQ<<16 | q<<8;
 252                 } else if (d->format & BAM_PLF_ALLBASE) { // collapse all bases
 253                         uint64_t rmsQ = 0;
 254                         uint32_t b = 0;
 255                         for (i = 0; i < n; ++i) {
 256                                 const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 257                                 int q = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 258                                 b |= bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos);
 259                                 rmsQ += q * q;
 260                         }
 261                         rmsQ = (uint64_t)(sqrt((double)rmsQ / n) + .499);
 262                         cns = b<<28 | 0xf<<24 | rmsQ<<16 | 60<<8;
 263                 } else {
 264                         glf1_t *g = bam_maqcns_glfgen(n, pu, bam_nt16_table[rb], d->c);
 265                         cns = g->depth == 0? (0xfu<<28 | 0xf<<24) : glf2cns(g, (int)(d->c->q_r + .499));
 266                         free(g);
 267                 }
 268         }
 269     if ((d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_INDEL_ONLY)) && d->ref && pos < d->len) { // call indels
 270         int m = (!d->max_depth || d->max_depth>n) ? n : d->max_depth;
 271         if (proposed_indels) // the first element gives the size of the array
 272             r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, proposed_indels[0], proposed_indels+1);
 273         else r = bam_maqindel(m, pos, d->ido, pu, d->ref, 0, 0);
 274         }
 275         // when only variant sites are asked for, test if the site is a variant
 276         if ((d->format & BAM_PLF_CNS) && (d->format & BAM_PLF_VAR_ONLY)) {
 277                 if (!(bam_nt16_table[rb] != 15 && cns>>28 != 15 && cns>>28 != bam_nt16_table[rb])) { // not a SNP
 278                         if (!(r && (r->gt == 2 || strcmp(r->s[r->gt], "*")))) { // not an indel
 279                                 if (r) bam_maqindel_ret_destroy(r);
 280                                 return 0;
 281                         }
 282                 }
 283         }
 284         // print the first 3 columns
 285         fputs(d->h->target_name[tid], stdout); putchar('\t');
 286         printw(pos+1, stdout); putchar('\t'); putchar(rb); putchar('\t');
 287         // print consensus information if required
 288         if (d->format & BAM_PLF_CNS) {
 289                 putchar(bam_nt16_rev_table[cns>>28]); putchar('\t');
 290                 printw(cns>>8&0xff, stdout); putchar('\t');
 291                 printw(cns&0xff, stdout); putchar('\t');
 292                 printw(cns>>16&0xff, stdout); putchar('\t');
 293         }
 294         // print pileup sequences
 295         printw(n, stdout); putchar('\t');
 296         for (i = 0; i < n; ++i)
 297                 pileup_seq(pu + i, pos, d->len, d->ref);
 298         // finalize rms_mapq
 299         if (d->format & BAM_PLF_CNS) {
 300                 for (i = rms_aux = 0; i < n; ++i) {
 301                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 302                         int tmp = p->b->core.qual < d->c->cap_mapQ? p->b->core.qual : d->c->cap_mapQ;
 303                         rms_aux += tmp * tmp;
 304                 }
 305                 rms_aux = (uint64_t)(sqrt((double)rms_aux / n) + .499);
 306                 if (rms_mapq < 0) rms_mapq = rms_aux;
 307         }
 308         putchar('\t');
 309         // print quality
 310         for (i = 0; i < n; ++i) {
 311                 const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 312                 int c = bam1_qual(p->b)[p->qpos] + 33;
 313                 if (c > 126) c = 126;
 314                 putchar(c);
 315         }
 316         if (d->format & BAM_PLF_2ND) { // print 2nd calls and qualities
 317                 const unsigned char *q;
 318                 putchar('\t');
 319                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 320                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 321                         q = bam_aux_get(p->b, "E2");
 322                         putchar(q? q[p->qpos + 1] : 'N');
 323                 }
 324                 putchar('\t');
 325                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 326                         const bam_pileup1_t *p = pu + i;
 327                         q = bam_aux_get(p->b, "U2");
 328                         putchar(q? q[p->qpos + 1] : '!');
 329                 }
 330         }
 331         // print mapping quality if -s is flagged on the command line
 332         if (d->format & BAM_PLF_SIMPLE) {
 333                 putchar('\t');
 334                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 335                         int c = pu[i].b->core.qual + 33;
 336                         if (c > 126) c = 126;
 337                         putchar(c);
 338                 }
 339         }
 340         // print read position
 341         if (d->format & BAM_PLF_READPOS) {
 342                 putchar('\t');
 343                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 344                         int x = pu[i].qpos;
 345                         int l = pu[i].b->core.l_qseq;
 346                         printw(x < l/2? x+1 : -((l-1)-x+1), stdout); putchar(',');
 347                 }
 348         }
 349         putchar('\n');
 350         // print the indel line if r has been calculated. This only happens if:
 351         // a) -c or -i are flagged, AND b) the reference sequence is available
 352         if (r) {
 353                 printf("%s\t%d\t*\t", d->h->target_name[tid], pos + 1);
 354                 if (r->gt < 2) printf("%s/%s\t", r->s[r->gt], r->s[r->gt]);
 355                 else printf("%s/%s\t", r->s[0], r->s[1]);
 356                 printf("%d\t%d\t", r->q_cns, r->q_ref);
 357                 printf("%d\t%d\t", rms_mapq, n);
 358                 printf("%s\t%s\t", r->s[0], r->s[1]);
 359                 //printf("%d\t%d\t", r->gl[0], r->gl[1]);
 360                 printf("%d\t%d\t%d\t", r->cnt1, r->cnt2, r->cnt_anti);
 361                 printf("%d\t%d\n", r->cnt_ref, r->cnt_ambi);
 362                 bam_maqindel_ret_destroy(r);
 363         }
 364         return 0;
 365 }
 366
 367 int bam_pileup(int argc, char *argv[])
 368 {
 369         int c, is_SAM = 0;
 370         char *fn_list = 0, *fn_fa = 0, *fn_pos = 0;
 371         pu_data_t *d = (pu_data_t*)calloc(1, sizeof(pu_data_t));
 372     d->max_depth = 1024; d->tid = -1; d->mask = BAM_DEF_MASK; d->min_baseQ = 13;
 373         d->c = bam_maqcns_init();
 374         d->c->errmod = BAM_ERRMOD_MAQ2; // change the default model
 375         d->ido = bam_maqindel_opt_init();
 376         while ((c = getopt(argc, argv, "st:f:cT:N:r:l:d:im:gI:G:vM:S2aR:PAQ:C:B")) >= 0) {
 377                 switch (c) {
 378                 case 'Q': d->c->min_baseQ = atoi(optarg); break;
 379                 case 'C': d->capQ_thres = atoi(optarg); break;
 380                 case 'B': d->format |= BAM_PLF_NOBAQ; break;
 381                 case 'a': d->c->errmod = BAM_ERRMOD_SOAP; break;
 382                 case 'A': d->c->errmod = BAM_ERRMOD_MAQ; break;
 383                 case 's': d->format |= BAM_PLF_SIMPLE; break;
 384                 case 't': fn_list = strdup(optarg); break;
 385                 case 'l': fn_pos = strdup(optarg); break;
 386                 case 'f': fn_fa = strdup(optarg); break;
 387                 case 'T': d->c->theta = atof(optarg); break;
 388                 case 'N': d->c->n_hap = atoi(optarg); break;
 389                 case 'r': d->c->het_rate = atof(optarg); d->ido->r_snp = d->c->het_rate; break;
 390                 case 'M': d->c->cap_mapQ = atoi(optarg); break;
 391                 case 'd': d->max_depth = atoi(optarg); break;
 392                 case 'c': d->format |= BAM_PLF_CNS; break;
 393                 case 'i': d->format |= BAM_PLF_INDEL_ONLY; break;
 394                 case 'v': d->format |= BAM_PLF_VAR_ONLY; break;
 395                 case 'm': d->mask = strtol(optarg, 0, 0); break;
 396                 case 'g': d->format |= BAM_PLF_GLF; break;
 397                 case '2': d->format |= BAM_PLF_2ND; break;
 398                 case 'P': d->format |= BAM_PLF_READPOS; break;
 399                 case 'I': d->ido->q_indel = atoi(optarg); break;
 400                 case 'G': d->ido->r_indel = atof(optarg); break;
 401                 case 'S': is_SAM = 1; break;
 402                 case 'R':
 403                         if (strcmp(optarg, "random") == 0) d->format |= BAM_PLF_RANBASE;
 404                         else if (strcmp(optarg, "first") == 0) d->format |= BAM_PLF_1STBASE;
 405                         else if (strcmp(optarg, "all") == 0) d->format |= BAM_PLF_ALLBASE;
 406                         else fprintf(stderr, "[bam_pileup] unrecognized -R\n");
 407                         break;
 408                 default: fprintf(stderr, "Unrecognizd option '-%c'.\n", c); return 1;
 409                 }
 410         }
 411         if (d->c->errmod != BAM_ERRMOD_MAQ2) d->c->theta += 0.02;
 412         if (d->c->theta > 1.0) d->c->theta = 1.0;
 413         if (fn_list) is_SAM = 1;
 414         if (optind == argc) {
 415                 fprintf(stderr, "\n");
 416                 fprintf(stderr, "Usage:  samtools pileup [options] <in.bam>|<in.sam>\n\n");
 417                 fprintf(stderr, "Option: -s        simple (yet incomplete) pileup format\n");
 418                 fprintf(stderr, "        -S        the input is in SAM\n");
 419                 fprintf(stderr, "        -B        disable BAQ computation\n");
 420                 fprintf(stderr, "        -A        use the original MAQ model for SNP calling (DEPRECATED)\n");
 421                 fprintf(stderr, "        -2        output the 2nd best call and quality\n");
 422                 fprintf(stderr, "        -i        only show lines/consensus with indels\n");
 423                 fprintf(stderr, "        -Q INT    min base quality (possibly capped by BAQ) [%d]\n", d->c->min_baseQ);
 424                 fprintf(stderr, "        -C INT    coefficient for adjusting mapQ of poor mappings [%d]\n", d->capQ_thres);
 425                 fprintf(stderr, "        -m INT    filtering reads with bits in INT [0x%x]\n", d->mask);
 426                 fprintf(stderr, "        -M INT    cap mapping quality at INT [%d]\n", d->c->cap_mapQ);
 427         fprintf(stderr, "        -d INT    limit maximum depth for indels [%d]\n", d->max_depth);
 428                 fprintf(stderr, "        -t FILE   list of reference sequences (force -S)\n");
 429                 fprintf(stderr, "        -l FILE   list of sites at which pileup is output\n");
 430                 fprintf(stderr, "        -f FILE   reference sequence in the FASTA format\n\n");
 431                 fprintf(stderr, "        -c        compute the consensus sequence\n");
 432                 fprintf(stderr, "        -v        print variants only (for -c)\n");
 433                 fprintf(stderr, "        -g        output in the GLFv3 format (DEPRECATED)\n");
 434                 fprintf(stderr, "        -T FLOAT  theta in maq consensus calling model (for -c) [%.4g]\n", d->c->theta);
 435                 fprintf(stderr, "        -N INT    number of haplotypes in the sample (for -c) [%d]\n", d->c->n_hap);
 436                 fprintf(stderr, "        -r FLOAT  prior of a difference between two haplotypes (for -c) [%.4g]\n", d->c->het_rate);
 437                 fprintf(stderr, "        -G FLOAT  prior of an indel between two haplotypes (for -c) [%.4g]\n", d->ido->r_indel);
 438                 fprintf(stderr, "        -I INT    phred prob. of an indel in sequencing/prep. (for -c) [%d]\n", d->ido->q_indel);
 439                 fprintf(stderr, "\n");
 440                 fprintf(stderr, "Warning: Please use the `mpileup' command instead `pileup'. `Pileup' is deprecated!\n\n");
 441                 free(fn_list); free(fn_fa); free(d);
 442                 return 1;
 443         }
 444         if (d->format & (BAM_PLF_RANBASE|BAM_PLF_1STBASE|BAM_PLF_ALLBASE)) d->format |= BAM_PLF_CNS;
 445         if (fn_fa) d->fai = fai_load(fn_fa);
 446         if (d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_GLF)) bam_maqcns_prepare(d->c); // consensus calling
 447         if (d->format & BAM_PLF_GLF) { // for glf output
 448                 glf3_header_t *h;
 449                 h = glf3_header_init();
 450                 d->fp_glf = bgzf_fdopen(fileno(stdout), "w");
 451                 glf3_header_write(d->fp_glf, h);
 452                 glf3_header_destroy(h);
 453         }
 454         if (d->fai == 0 && (d->format & (BAM_PLF_CNS|BAM_PLF_INDEL_ONLY)))
 455                 fprintf(stderr, "[bam_pileup] indels will not be called when -f is absent.\n");
 456         if (fn_fa && is_SAM && fn_list == 0) fn_list = samfaipath(fn_fa);
 457
 458         {
 459                 samfile_t *fp;
 460                 fp = is_SAM? samopen(argv[optind], "r", fn_list) : samopen(argv[optind], "rb", 0);
 461                 if (fp == 0 || fp->header == 0) {
 462                         fprintf(stderr, "[bam_pileup] fail to read the header: non-exisiting file or wrong format.\n");
 463                         return 1;
 464                 }
 465                 d->h = fp->header;
 466                 if (fn_pos) d->hash = load_pos(fn_pos, d->h);
 467                 { // run pileup
 468                         extern int bam_prob_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 469                         extern int bam_cap_mapQ(bam1_t *b, char *ref, int thres);
 470                         bam1_t *b;
 471                         int ret, tid, pos, n_plp;
 472                         bam_plp_t iter;
 473                         const bam_pileup1_t *plp;
 474                         b = bam_init1();
 475                         iter = bam_plp_init(0, 0);
 476                         bam_plp_set_mask(iter, d->mask);
 477                         while ((ret = samread(fp, b)) >= 0) {
 478                                 int skip = 0;
 479                                 if ((int)b->core.tid < 0) break;
 480                                 // update d->ref if necessary
 481                                 if (d->fai && (int)b->core.tid != d->tid) {
 482                                         free(d->ref);
 483                                         d->ref = faidx_fetch_seq(d->fai, d->h->target_name[b->core.tid], 0, 0x7fffffff, &d->len);
 484                                         d->tid = b->core.tid;
 485                                 }
 486                                 if (d->ref && (d->format&BAM_PLF_CNS) && !(d->format&BAM_PLF_NOBAQ)) bam_prob_realn(b, d->ref);
 487                                 if (d->ref && (d->format&BAM_PLF_CNS) && d->capQ_thres > 10) {
 488                                         int q = bam_cap_mapQ(b, d->ref, d->capQ_thres);
 489                                         if (q < 0) skip = 1;
 490                                         else if (b->core.qual > q) b->core.qual = q;
 491                                 } else if (b->core.flag&BAM_FUNMAP) skip = 1;
 492                                 else if ((d->format&BAM_PLF_CNS) && (b->core.flag&1) && !(b->core.flag&2)) skip = 1;
 493                                 if (skip) continue;
 494                                 bam_plp_push(iter, b);
 495                                 while ((plp = bam_plp_next(iter, &tid, &pos, &n_plp)) != 0)
 496                                         pileup_func(tid, pos, n_plp, plp, d);
 497                         }
 498                         bam_plp_push(iter, 0);
 499                         while ((plp = bam_plp_next(iter, &tid, &pos, &n_plp)) != 0)
 500                                 pileup_func(tid, pos, n_plp, plp, d);
 501                         bam_plp_destroy(iter);
 502                         bam_destroy1(b);
 503                 }
 504                 samclose(fp); // d->h will be destroyed here
 505         }
 506
 507         // free
 508         if (d->format & BAM_PLF_GLF) bgzf_close(d->fp_glf);
 509         if (fn_pos) { // free the hash table
 510                 khint_t k;
 511                 for (k = kh_begin(d->hash); k < kh_end(d->hash); ++k)
 512                         if (kh_exist(d->hash, k)) free(kh_val(d->hash, k));
 513                 kh_destroy(64, d->hash);
 514         }
 515         free(fn_pos); free(fn_list); free(fn_fa);
 516         if (d->fai) fai_destroy(d->fai);
 517         bam_maqcns_destroy(d->c);
 518         free(d->ido); free(d->ref); free(d);
 519         return 0;
 520 }
 521
 522 /***********
 523  * mpileup *
 524  ***********/
 525
 526 #include <assert.h>
 527 #include "bam2bcf.h"
 528 #include "sample.h"
 529
 530 #define MPLP_GLF   0x10
 531 #define MPLP_NO_COMP 0x20
 532 #define MPLP_NO_ORPHAN 0x40
 533 #define MPLP_REALN   0x80
 534 #define MPLP_FMT_DP 0x100
 535 #define MPLP_FMT_SP 0x200
 536 #define MPLP_NO_INDEL 0x400
 537 #define MPLP_EXT_BAQ 0x800
 538 #define MPLP_ILLUMINA13 0x1000
 539
 540 void *bed_read(const char *fn);
 541 void bed_destroy(void *_h);
 542 int bed_overlap(const void *_h, const char *chr, int beg, int end);
 543
 544 typedef struct {
 545         int max_mq, min_mq, flag, min_baseQ, capQ_thres, max_depth, max_indel_depth;
 546         int openQ, extQ, tandemQ, min_support; // for indels
 547         double min_frac; // for indels
 548         char *reg, *pl_list;
 549         faidx_t *fai;
 550         void *bed, *rghash;
 551 } mplp_conf_t;
 552
 553 typedef struct {
 554         bamFile fp;
 555         bam_iter_t iter;
 556         bam_header_t *h;
 557         int ref_id;
 558         char *ref;
 559         const mplp_conf_t *conf;
 560 } mplp_aux_t;
 561
 562 typedef struct {
 563         int n;
 564         int *n_plp, *m_plp;
 565         bam_pileup1_t **plp;
 566 } mplp_pileup_t;
 567
 568 static int mplp_func(void *data, bam1_t *b)
 569 {
 570         extern int bam_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 571         extern int bam_prob_realn_core(bam1_t *b, const char *ref, int);
 572         extern int bam_cap_mapQ(bam1_t *b, char *ref, int thres);
 573         mplp_aux_t *ma = (mplp_aux_t*)data;
 574         int ret, skip = 0;
 575         do {
 576                 int has_ref;
 577                 ret = ma->iter? bam_iter_read(ma->fp, ma->iter, b) : bam_read1(ma->fp, b);
 578                 if (ret < 0) break;
 579                 if (b->core.tid < 0 || (b->core.flag&BAM_FUNMAP)) { // exclude unmapped reads
 580                         skip = 1;
 581                         continue;
 582                 }
 583                 if (ma->conf->bed) { // test overlap
 584                         skip = !bed_overlap(ma->conf->bed, ma->h->target_name[b->core.tid], b->core.pos, bam_calend(&b->core, bam1_cigar(b)));
 585                         if (skip) continue;
 586                 }
 587                 if (ma->conf->rghash) { // exclude read groups
 588                         uint8_t *rg = bam_aux_get(b, "RG");
 589                         skip = (rg && bcf_str2id(ma->conf->rghash, (const char*)(rg+1)) >= 0);
 590                         if (skip) continue;
 591                 }
 592                 if (ma->conf->flag & MPLP_ILLUMINA13) {
 593                         int i;
 594                         uint8_t *qual = bam1_qual(b);
 595                         for (i = 0; i < b->core.l_qseq; ++i)
 596                                 qual[i] = qual[i] > 31? qual[i] - 31 : 0;
 597                 }
 598                 has_ref = (ma->ref && ma->ref_id == b->core.tid)? 1 : 0;
 599                 skip = 0;
 600                 if (has_ref && (ma->conf->flag&MPLP_REALN)) bam_prob_realn_core(b, ma->ref, (ma->conf->flag & MPLP_EXT_BAQ)? 3 : 1);
 601                 if (has_ref && ma->conf->capQ_thres > 10) {
 602                         int q = bam_cap_mapQ(b, ma->ref, ma->conf->capQ_thres);
 603                         if (q < 0) skip = 1;
 604                         else if (b->core.qual > q) b->core.qual = q;
 605                 }
 606                 else if (b->core.qual < ma->conf->min_mq) skip = 1;
 607                 else if ((ma->conf->flag&MPLP_NO_ORPHAN) && (b->core.flag&1) && !(b->core.flag&2)) skip = 1;
 608         } while (skip);
 609         return ret;
 610 }
 611
 612 static void group_smpl(mplp_pileup_t *m, bam_sample_t *sm, kstring_t *buf,
 613                                            int n, char *const*fn, int *n_plp, const bam_pileup1_t **plp)
 614 {
 615         int i, j;
 616         memset(m->n_plp, 0, m->n * sizeof(int));
 617         for (i = 0; i < n; ++i) {
 618                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 619                         const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 620                         uint8_t *q;
 621                         int id = -1;
 622                         q = bam_aux_get(p->b, "RG");
 623                         if (q) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], (char*)q+1, buf);
 624                         if (id < 0) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], 0, buf);
 625                         if (id < 0 || id >= m->n) {
 626                                 assert(q); // otherwise a bug
 627                                 fprintf(stderr, "[%s] Read group %s used in file %s but absent from the header or an alignment missing read group.\n", __func__, (char*)q+1, fn[i]);
 628                                 exit(1);
 629                         }
 630                         if (m->n_plp[id] == m->m_plp[id]) {
 631                                 m->m_plp[id] = m->m_plp[id]? m->m_plp[id]<<1 : 8;
 632                                 m->plp[id] = realloc(m->plp[id], sizeof(bam_pileup1_t) * m->m_plp[id]);
 633                         }
 634                         m->plp[id][m->n_plp[id]++] = *p;
 635                 }
 636         }
 637 }
 638
 639 static int mpileup(mplp_conf_t *conf, int n, char **fn)
 640 {
 641         extern void *bcf_call_add_rg(void *rghash, const char *hdtext, const char *list);
 642         extern void bcf_call_del_rghash(void *rghash);
 643         mplp_aux_t **data;
 644         int i, tid, pos, *n_plp, beg0 = 0, end0 = 1u<<29, ref_len, ref_tid, max_depth, max_indel_depth;
 645         const bam_pileup1_t **plp;
 646         bam_mplp_t iter;
 647         bam_header_t *h = 0;
 648         char *ref;
 649         void *rghash = 0;
 650
 651         bcf_callaux_t *bca = 0;
 652         bcf_callret1_t *bcr = 0;
 653         bcf_call_t bc;
 654         bcf_t *bp = 0;
 655         bcf_hdr_t *bh = 0;
 656
 657         bam_sample_t *sm = 0;
 658         kstring_t buf;
 659         mplp_pileup_t gplp;
 660
 661         memset(&gplp, 0, sizeof(mplp_pileup_t));
 662         memset(&buf, 0, sizeof(kstring_t));
 663         memset(&bc, 0, sizeof(bcf_call_t));
 664         data = calloc(n, sizeof(void*));
 665         plp = calloc(n, sizeof(void*));
 666         n_plp = calloc(n, sizeof(int*));
 667         sm = bam_smpl_init();
 668
 669         // read the header and initialize data
 670         for (i = 0; i < n; ++i) {
 671                 bam_header_t *h_tmp;
 672                 data[i] = calloc(1, sizeof(mplp_aux_t));
 673                 data[i]->fp = strcmp(fn[i], "-") == 0? bam_dopen(fileno(stdin), "r") : bam_open(fn[i], "r");
 674                 data[i]->conf = conf;
 675                 h_tmp = bam_header_read(data[i]->fp);
 676                 data[i]->h = i? h : h_tmp; // for i==0, "h" has not been set yet
 677                 bam_smpl_add(sm, fn[i], h_tmp->text);
 678                 rghash = bcf_call_add_rg(rghash, h_tmp->text, conf->pl_list);
 679                 if (conf->reg) {
 680                         int beg, end;
 681                         bam_index_t *idx;
 682                         idx = bam_index_load(fn[i]);
 683                         if (idx == 0) {
 684                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to load index for %d-th input.\n", __func__, i+1);
 685                                 exit(1);
 686                         }
 687                         if (bam_parse_region(h_tmp, conf->reg, &tid, &beg, &end) < 0) {
 688                                 fprintf(stderr, "[%s] malformatted region or wrong seqname for %d-th input.\n", __func__, i+1);
 689                                 exit(1);
 690                         }
 691                         if (i == 0) beg0 = beg, end0 = end;
 692                         data[i]->iter = bam_iter_query(idx, tid, beg, end);
 693                         bam_index_destroy(idx);
 694                 }
 695                 if (i == 0) h = h_tmp;
 696                 else {
 697                         // FIXME: to check consistency
 698                         bam_header_destroy(h_tmp);
 699                 }
 700         }
 701         gplp.n = sm->n;
 702         gplp.n_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 703         gplp.m_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 704         gplp.plp = calloc(sm->n, sizeof(void*));
 705
 706         fprintf(stderr, "[%s] %d samples in %d input files\n", __func__, sm->n, n);
 707         // write the VCF header
 708         if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 709                 kstring_t s;
 710                 bh = calloc(1, sizeof(bcf_hdr_t));
 711                 s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 712                 bp = bcf_open("-", (conf->flag&MPLP_NO_COMP)? "wu" : "w");
 713                 for (i = 0; i < h->n_targets; ++i) {
 714                         kputs(h->target_name[i], &s);
 715                         kputc('\0', &s);
 716                 }
 717                 bh->l_nm = s.l;
 718                 bh->name = malloc(s.l);
 719                 memcpy(bh->name, s.s, s.l);
 720                 s.l = 0;
 721                 for (i = 0; i < sm->n; ++i) {
 722                         kputs(sm->smpl[i], &s); kputc('\0', &s);
 723                 }
 724                 bh->l_smpl = s.l;
 725                 bh->sname = malloc(s.l);
 726                 memcpy(bh->sname, s.s, s.l);
 727                 bh->txt = malloc(strlen(BAM_VERSION) + 64);
 728                 bh->l_txt = 1 + sprintf(bh->txt, "##samtoolsVersion=%s\n", BAM_VERSION);
 729                 free(s.s);
 730                 bcf_hdr_sync(bh);
 731                 bcf_hdr_write(bp, bh);
 732                 bca = bcf_call_init(-1., conf->min_baseQ);
 733                 bcr = calloc(sm->n, sizeof(bcf_callret1_t));
 734                 bca->rghash = rghash;
 735                 bca->openQ = conf->openQ, bca->extQ = conf->extQ, bca->tandemQ = conf->tandemQ;
 736                 bca->min_frac = conf->min_frac;
 737                 bca->min_support = conf->min_support;
 738         }
 739         ref_tid = -1; ref = 0;
 740         iter = bam_mplp_init(n, mplp_func, (void**)data);
 741         max_depth = conf->max_depth;
 742         if (max_depth * sm->n > 1<<20)
 743                 fprintf(stderr, "(%s) Max depth is above 1M. Potential memory hog!\n", __func__);
 744         if (max_depth * sm->n < 8000) {
 745                 max_depth = 8000 / sm->n;
 746                 fprintf(stderr, "<%s> Set max per-file depth to %d\n", __func__, max_depth);
 747         }
 748         max_indel_depth = conf->max_indel_depth * sm->n;
 749         bam_mplp_set_maxcnt(iter, max_depth);
 750         while (bam_mplp_auto(iter, &tid, &pos, n_plp, plp) > 0) {
 751                 if (conf->reg && (pos < beg0 || pos >= end0)) continue; // out of the region requested
 752                 if (conf->bed && tid >= 0 && !bed_overlap(conf->bed, h->target_name[tid], pos, pos+1)) continue;
 753                 if (tid != ref_tid) {
 754                         free(ref); ref = 0;
 755                         if (conf->fai) ref = fai_fetch(conf->fai, h->target_name[tid], &ref_len);
 756                         for (i = 0; i < n; ++i) data[i]->ref = ref, data[i]->ref_id = tid;
 757                         ref_tid = tid;
 758                 }
 759                 if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 760                         int total_depth, _ref0, ref16;
 761                         bcf1_t *b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 762                         for (i = total_depth = 0; i < n; ++i) total_depth += n_plp[i];
 763                         group_smpl(&gplp, sm, &buf, n, fn, n_plp, plp);
 764                         _ref0 = (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N';
 765                         ref16 = bam_nt16_table[_ref0];
 766                         for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 767                                 bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], ref16, bca, bcr + i);
 768                         bcf_call_combine(gplp.n, bcr, ref16, &bc);
 769                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b, (conf->flag&(MPLP_FMT_DP|MPLP_FMT_SP))? bcr : 0,
 770                                                  (conf->flag&MPLP_FMT_SP), 0, 0);
 771                         bcf_write(bp, bh, b);
 772                         bcf_destroy(b);
 773                         // call indels
 774                         if (!(conf->flag&MPLP_NO_INDEL) && total_depth < max_indel_depth && bcf_call_gap_prep(gplp.n, gplp.n_plp, gplp.plp, pos, bca, ref, rghash) >= 0) {
 775                                 for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 776                                         bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], -1, bca, bcr + i);
 777                                 if (bcf_call_combine(gplp.n, bcr, -1, &bc) >= 0) {
 778                                         b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 779                                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b, (conf->flag&(MPLP_FMT_DP|MPLP_FMT_SP))? bcr : 0,
 780                                                                  (conf->flag&MPLP_FMT_SP), bca, ref);
 781                                         bcf_write(bp, bh, b);
 782                                         bcf_destroy(b);
 783                                 }
 784                         }
 785                 } else {
 786                         printf("%s\t%d\t%c", h->target_name[tid], pos + 1, (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N');
 787                         for (i = 0; i < n; ++i) {
 788                                 int j;
 789                                 printf("\t%d\t", n_plp[i]);
 790                                 if (n_plp[i] == 0) printf("*\t*");
 791                                 else {
 792                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j)
 793                                                 pileup_seq(plp[i] + j, pos, ref_len, ref);
 794                                         putchar('\t');
 795                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 796                                                 const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 797                                                 int c = bam1_qual(p->b)[p->qpos] + 33;
 798                                                 if (c > 126) c = 126;
 799                                                 putchar(c);
 800                                         }
 801                                 }
 802                         }
 803                         putchar('\n');
 804                 }
 805         }
 806
 807         bcf_close(bp);
 808         bam_smpl_destroy(sm); free(buf.s);
 809         for (i = 0; i < gplp.n; ++i) free(gplp.plp[i]);
 810         free(gplp.plp); free(gplp.n_plp); free(gplp.m_plp);
 811         bcf_call_del_rghash(rghash);
 812         bcf_hdr_destroy(bh); bcf_call_destroy(bca); free(bc.PL); free(bcr);
 813         bam_mplp_destroy(iter);
 814         bam_header_destroy(h);
 815         for (i = 0; i < n; ++i) {
 816                 bam_close(data[i]->fp);
 817                 if (data[i]->iter) bam_iter_destroy(data[i]->iter);
 818                 free(data[i]);
 819         }
 820         free(data); free(plp); free(ref); free(n_plp);
 821         return 0;
 822 }
 823
 824 #define MAX_PATH_LEN 1024
 825 static int read_file_list(const char *file_list,int *n,char **argv[])
 826 {
 827     char buf[MAX_PATH_LEN];
 828     int len, nfiles;
 829     char **files;
 830
 831     FILE *fh = fopen(file_list,"r");
 832     if ( !fh )
 833     {
 834         fprintf(stderr,"%s: %s\n", file_list,strerror(errno));
 835         return 1;
 836     }
 837
 838     // Speed is not an issue here, determine the number of files by reading the file twice
 839     nfiles = 0;
 840     while ( fgets(buf,MAX_PATH_LEN,fh) ) nfiles++;
 841
 842     if ( fseek(fh, 0L, SEEK_SET) )
 843     {
 844         fprintf(stderr,"%s: %s\n", file_list,strerror(errno));
 845         return 1;
 846     }
 847
 848     files = calloc(nfiles,sizeof(char*));
 849     nfiles = 0;
 850     while ( fgets(buf,MAX_PATH_LEN,fh) )
 851     {
 852         len = strlen(buf);
 853         while ( len>0 && isspace(buf[len-1]) ) len--;
 854         if ( !len ) continue;
 855
 856         files[nfiles] = malloc(sizeof(char)*(len+1));
 857         strncpy(files[nfiles],buf,len);
 858         files[nfiles][len] = 0;
 859         nfiles++;
 860     }
 861     fclose(fh);
 862     if ( !nfiles )
 863     {
 864         fprintf(stderr,"No files read from %s\n", file_list);
 865         return 1;
 866     }
 867     *argv = files;
 868     *n    = nfiles;
 869     return 0;
 870 }
 871 #undef MAX_PATH_LEN
 872
 873 int bam_mpileup(int argc, char *argv[])
 874 {
 875         int c;
 876     const char *file_list = NULL;
 877     char **fn = NULL;
 878     int nfiles = 0, use_orphan = 0;
 879         mplp_conf_t mplp;
 880         memset(&mplp, 0, sizeof(mplp_conf_t));
 881         mplp.max_mq = 60;
 882         mplp.min_baseQ = 13;
 883         mplp.capQ_thres = 0;
 884         mplp.max_depth = 250; mplp.max_indel_depth = 250;
 885         mplp.openQ = 40; mplp.extQ = 20; mplp.tandemQ = 100;
 886         mplp.min_frac = 0.002; mplp.min_support = 1;
 887         mplp.flag = MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN;
 888         while ((c = getopt(argc, argv, "Agf:r:l:M:q:Q:uaRC:BDSd:L:b:P:o:e:h:Im:F:EG:6")) >= 0) {
 889                 switch (c) {
 890                 case 'f':
 891                         mplp.fai = fai_load(optarg);
 892                         if (mplp.fai == 0) return 1;
 893                         break;
 894                 case 'd': mplp.max_depth = atoi(optarg); break;
 895                 case 'r': mplp.reg = strdup(optarg); break;
 896                 case 'l': mplp.bed = bed_read(optarg); break;
 897                 case 'P': mplp.pl_list = strdup(optarg); break;
 898                 case 'g': mplp.flag |= MPLP_GLF; break;
 899                 case 'u': mplp.flag |= MPLP_NO_COMP | MPLP_GLF; break;
 900                 case 'a': mplp.flag |= MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN; break;
 901                 case 'B': mplp.flag &= ~MPLP_REALN; break;
 902                 case 'R': mplp.flag |= MPLP_REALN; break;
 903                 case 'D': mplp.flag |= MPLP_FMT_DP; break;
 904                 case 'S': mplp.flag |= MPLP_FMT_SP; break;
 905                 case 'I': mplp.flag |= MPLP_NO_INDEL; break;
 906                 case 'E': mplp.flag |= MPLP_EXT_BAQ; break;
 907                 case '6': mplp.flag |= MPLP_ILLUMINA13; break;
 908                 case 'C': mplp.capQ_thres = atoi(optarg); break;
 909                 case 'M': mplp.max_mq = atoi(optarg); break;
 910                 case 'q': mplp.min_mq = atoi(optarg); break;
 911                 case 'Q': mplp.min_baseQ = atoi(optarg); break;
 912         case 'b': file_list = optarg; break;
 913                 case 'o': mplp.openQ = atoi(optarg); break;
 914                 case 'e': mplp.extQ = atoi(optarg); break;
 915                 case 'h': mplp.tandemQ = atoi(optarg); break;
 916                 case 'A': use_orphan = 1; break;
 917                 case 'F': mplp.min_frac = atof(optarg); break;
 918                 case 'm': mplp.min_support = atoi(optarg); break;
 919                 case 'L': mplp.max_indel_depth = atoi(optarg); break;
 920                 case 'G': {
 921                                 FILE *fp_rg;
 922                                 char buf[1024];
 923                                 mplp.rghash = bcf_str2id_init();
 924                                 if ((fp_rg = fopen(optarg, "r")) == 0)
 925                                         fprintf(stderr, "(%s) Fail to open file %s. Continue anyway.\n", __func__, optarg);
 926                                 while (!feof(fp_rg) && fscanf(fp_rg, "%s", buf) > 0) // this is not a good style, but forgive me...
 927                                         bcf_str2id_add(mplp.rghash, strdup(buf));
 928                                 fclose(fp_rg);
 929                         }
 930                         break;
 931                 }
 932         }
 933         if (use_orphan) mplp.flag &= ~MPLP_NO_ORPHAN;
 934         if (argc == 1) {
 935                 fprintf(stderr, "\n");
 936                 fprintf(stderr, "Usage: samtools mpileup [options] in1.bam [in2.bam [...]]\n\n");
 937                 fprintf(stderr, "Input options:\n\n");
 938                 fprintf(stderr, "       -6           assume the quality is in the Illumina-1.3+ encoding\n");
 939                 fprintf(stderr, "       -A           count anomalous read pairs\n");
 940                 fprintf(stderr, "       -B           disable BAQ computation\n");
 941                 fprintf(stderr, "       -b FILE      list of input BAM files [null]\n");
 942                 fprintf(stderr, "       -d INT       max per-BAM depth to avoid excessive memory usage [%d]\n", mplp.max_depth);
 943                 fprintf(stderr, "       -E           extended BAQ for higher sensitivity but lower specificity\n");
 944                 fprintf(stderr, "       -f FILE      faidx indexed reference sequence file [null]\n");
 945                 fprintf(stderr, "       -G FILE      exclude read groups listed in FILE [null]\n");
 946                 fprintf(stderr, "       -l FILE      list of positions (chr pos) or regions (BED) [null]\n");
 947                 fprintf(stderr, "       -M INT       cap mapping quality at INT [%d]\n", mplp.max_mq);
 948                 fprintf(stderr, "       -r STR       region in which pileup is generated [null]\n");
 949                 fprintf(stderr, "       -q INT       skip alignments with mapQ smaller than INT [%d]\n", mplp.min_mq);
 950                 fprintf(stderr, "       -Q INT       skip bases with baseQ/BAQ smaller than INT [%d]\n", mplp.min_baseQ);
 951                 fprintf(stderr, "\nOutput options:\n\n");
 952                 fprintf(stderr, "       -D           output per-sample DP in BCF (require -g/-u)\n");
 953                 fprintf(stderr, "       -g           generate BCF output (genotype likelihoods)\n");
 954                 fprintf(stderr, "       -S           output per-sample strand bias P-value in BCF (require -g/-u)\n");
 955                 fprintf(stderr, "       -u           generate uncompress BCF output\n");
 956                 fprintf(stderr, "\nSNP/INDEL genotype likelihoods options (effective with `-g' or `-u'):\n\n");
 957                 fprintf(stderr, "       -e INT       Phred-scaled gap extension seq error probability [%d]\n", mplp.extQ);
 958                 fprintf(stderr, "       -F FLOAT     minimum fraction of gapped reads for candidates [%g]\n", mplp.min_frac);
 959                 fprintf(stderr, "       -h INT       coefficient for homopolymer errors [%d]\n", mplp.tandemQ);
 960                 fprintf(stderr, "       -I           do not perform indel calling\n");
 961                 fprintf(stderr, "       -L INT       max per-sample depth for INDEL calling [%d]\n", mplp.max_indel_depth);
 962                 fprintf(stderr, "       -m INT       minimum gapped reads for indel candidates [%d]\n", mplp.min_support);
 963                 fprintf(stderr, "       -o INT       Phred-scaled gap open sequencing error probability [%d]\n", mplp.openQ);
 964                 fprintf(stderr, "       -P STR       comma separated list of platforms for indels [all]\n");
 965                 fprintf(stderr, "\n");
 966                 fprintf(stderr, "Notes: Assuming diploid individuals.\n\n");
 967                 return 1;
 968         }
 969     if (file_list) {
 970         if ( read_file_list(file_list,&nfiles,&fn) ) return 1;
 971         mpileup(&mplp,nfiles,fn);
 972         for (c=0; c<nfiles; c++) free(fn[c]);
 973         free(fn);
 974     } else mpileup(&mplp, argc - optind, argv + optind);
 975         if (mplp.rghash) bcf_str2id_thorough_destroy(mplp.rghash);
 976         free(mplp.reg); free(mplp.pl_list);
 977         if (mplp.fai) fai_destroy(mplp.fai);
 978         if (mplp.bed) bed_destroy(mplp.bed);
 979         return 0;
 980 }