bcftools/call1.c

   1 #include <unistd.h>
   2 #include <stdlib.h>
   3 #include <math.h>
   4 #include <zlib.h>
   5 #include <errno.h>
   6 #include "bcf.h"
   7 #include "prob1.h"
   8 #include "kstring.h"
   9 #include "time.h"
  10
  11 #include "kseq.h"
  12 KSTREAM_INIT(gzFile, gzread, 16384)
  13
  14 #define VC_NO_GENO 2
  15 #define VC_BCFOUT  4
  16 #define VC_CALL    8
  17 #define VC_VARONLY 16
  18 #define VC_VCFIN   32
  19 #define VC_UNCOMP  64
  20 #define VC_KEEPALT 256
  21 #define VC_ACGT_ONLY 512
  22 #define VC_QCALL   1024
  23 #define VC_CALL_GT 2048
  24 #define VC_ADJLD   4096
  25 #define VC_NO_INDEL 8192
  26 #define VC_ANNO_MAX 16384
  27 #define VC_FIX_PL   32768
  28 #define VC_EM       0x10000
  29
  30 typedef struct {
  31         int flag, prior_type, n1, n_sub, *sublist, n_perm;
  32         char *prior_file, **subsam, *fn_dict;
  33         uint8_t *ploidy;
  34         double theta, pref, indel_frac, min_perm_p, min_smpl_frac, min_lrt;
  35         void *bed;
  36 } viewconf_t;
  37
  38 void *bed_read(const char *fn);
  39 void bed_destroy(void *_h);
  40 int bed_overlap(const void *_h, const char *chr, int beg, int end);
  41
  42 typedef struct {
  43         double p[4];
  44         int mq, depth, is_tested, d[4];
  45 } anno16_t;
  46
  47 static double ttest(int n1, int n2, int a[4])
  48 {
  49         extern double kf_betai(double a, double b, double x);
  50         double t, v, u1, u2;
  51         if (n1 == 0 || n2 == 0 || n1 + n2 < 3) return 1.0;
  52         u1 = (double)a[0] / n1; u2 = (double)a[2] / n2;
  53         if (u1 <= u2) return 1.;
  54         t = (u1 - u2) / sqrt(((a[1] - n1 * u1 * u1) + (a[3] - n2 * u2 * u2)) / (n1 + n2 - 2) * (1./n1 + 1./n2));
  55         v = n1 + n2 - 2;
  56 //      printf("%d,%d,%d,%d,%lf,%lf,%lf\n", a[0], a[1], a[2], a[3], t, u1, u2);
  57         return t < 0.? 1. : .5 * kf_betai(.5*v, .5, v/(v+t*t));
  58 }
  59
  60 static int test16_core(int anno[16], anno16_t *a)
  61 {
  62         extern double kt_fisher_exact(int n11, int n12, int n21, int n22, double *_left, double *_right, double *two);
  63         double left, right;
  64         int i;
  65         a->p[0] = a->p[1] = a->p[2] = a->p[3] = 1.;
  66         memcpy(a->d, anno, 4 * sizeof(int));
  67         a->depth = anno[0] + anno[1] + anno[2] + anno[3];
  68         a->is_tested = (anno[0] + anno[1] > 0 && anno[2] + anno[3] > 0);
  69         if (a->depth == 0) return -1;
  70         a->mq = (int)(sqrt((anno[9] + anno[11]) / a->depth) + .499);
  71         kt_fisher_exact(anno[0], anno[1], anno[2], anno[3], &left, &right, &a->p[0]);
  72         for (i = 1; i < 4; ++i)
  73                 a->p[i] = ttest(anno[0] + anno[1], anno[2] + anno[3], anno+4*i);
  74         return 0;
  75 }
  76
  77 static int test16(bcf1_t *b, anno16_t *a)
  78 {
  79         char *p;
  80         int i, anno[16];
  81         a->p[0] = a->p[1] = a->p[2] = a->p[3] = 1.;
  82         a->d[0] = a->d[1] = a->d[2] = a->d[3] = 0.;
  83         a->mq = a->depth = a->is_tested = 0;
  84         if ((p = strstr(b->info, "I16=")) == 0) return -1;
  85         p += 4;
  86         for (i = 0; i < 16; ++i) {
  87                 errno = 0; anno[i] = strtol(p, &p, 10);
  88                 if (anno[i] == 0 && (errno == EINVAL || errno == ERANGE)) return -2;
  89                 ++p;
  90         }
  91         return test16_core(anno, a);
  92 }
  93
  94 static void rm_info(bcf1_t *b, const char *key)
  95 {
  96         char *p, *q;
  97         if ((p = strstr(b->info, key)) == 0) return;
  98         for (q = p; *q && *q != ';'; ++q);
  99         if (p > b->info && *(p-1) == ';') --p;
 100         memmove(p, q, b->l_str - (q - b->str));
 101         b->l_str -= q - p;
 102         bcf_sync(b);
 103 }
 104
 105 static int update_bcf1(bcf1_t *b, const bcf_p1aux_t *pa, const bcf_p1rst_t *pr, double pref, int flag, double em[9])
 106 {
 107         kstring_t s;
 108         int has_I16, is_var;
 109         double fq, r;
 110         anno16_t a;
 111
 112         has_I16 = test16(b, &a) >= 0? 1 : 0;
 113         rm_info(b, "I16="); // FIXME: probably this function has a bug. If I move it below, I16 will not be removed!
 114
 115         memset(&s, 0, sizeof(kstring_t));
 116         kputc('\0', &s); kputs(b->ref, &s); kputc('\0', &s);
 117         kputs(b->alt, &s); kputc('\0', &s); kputc('\0', &s);
 118         kputs(b->info, &s);
 119         if (b->info[0]) kputc(';', &s);
 120         { // print EM
 121                 if (em[0] >= 0) ksprintf(&s, "AF1=%.4g", 1 - em[0]);
 122                 if (em[4] >= 0 && em[4] <= 0.05) ksprintf(&s, ";G3=%.4g,%.4g,%.4g;HWE=%.3g", em[3], em[2], em[1], em[4]);
 123                 if (em[5] >= 0 && em[6] >= 0) ksprintf(&s, ";AF2=%.4g,%.4g", 1 - em[5], 1 - em[6]);
 124                 if (em[7] >= 0) ksprintf(&s, ";LRT=%.3g", em[7]);
 125         }
 126         if (pr == 0) { // if pr is unset, return
 127                 kputc('\0', &s); kputs(b->fmt, &s); kputc('\0', &s);
 128                 free(b->str);
 129                 b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 130                 bcf_sync(b);
 131                 return 1;
 132         }
 133
 134         is_var = (pr->p_ref < pref);
 135         r = is_var? pr->p_ref : pr->p_var;
 136
 137         ksprintf(&s, ";CI95=%.4g,%.4g", pr->cil, pr->cih); // FIXME: when EM is not used, ";" should be omitted!
 138         if (has_I16) ksprintf(&s, ";DP4=%d,%d,%d,%d;MQ=%d", a.d[0], a.d[1], a.d[2], a.d[3], a.mq);
 139         fq = pr->p_ref_folded < 0.5? -4.343 * log(pr->p_ref_folded) : 4.343 * log(pr->p_var_folded);
 140         if (fq < -999) fq = -999;
 141         if (fq > 999) fq = 999;
 142         ksprintf(&s, ";FQ=%.3g", fq);
 143         if (pr->cmp[0] >= 0.) { // two sample groups
 144                 int i, q[3];
 145                 for (i = 1; i < 3; ++i) {
 146                         double x = pr->cmp[i] + pr->cmp[0]/2.;
 147                         q[i] = x == 0? 255 : (int)(-4.343 * log(x) + .499);
 148                         if (q[i] > 255) q[i] = 255;
 149                 }
 150                 if (pr->perm_rank >= 0) ksprintf(&s, ";PR=%d", pr->perm_rank);
 151                 ksprintf(&s, ";PCHI2=%.3g;PC2=%d,%d", q[1], q[2], pr->p_chi2);
 152         }
 153         if (has_I16 && a.is_tested) ksprintf(&s, ";PV4=%.2g,%.2g,%.2g,%.2g", a.p[0], a.p[1], a.p[2], a.p[3]);
 154         kputc('\0', &s);
 155         kputs(b->fmt, &s); kputc('\0', &s);
 156         free(b->str);
 157         b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 158         b->qual = r < 1e-100? 999 : -4.343 * log(r);
 159         if (b->qual > 999) b->qual = 999;
 160         bcf_sync(b);
 161         if (!is_var) bcf_shrink_alt(b, 1);
 162         else if (!(flag&VC_KEEPALT))
 163                 bcf_shrink_alt(b, pr->rank0 < 2? 2 : pr->rank0+1);
 164         if (is_var && (flag&VC_CALL_GT)) { // call individual genotype
 165                 int i, x, old_n_gi = b->n_gi;
 166                 s.m = b->m_str; s.l = b->l_str - 1; s.s = b->str;
 167                 kputs(":GT:GQ", &s); kputc('\0', &s);
 168                 b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 169                 bcf_sync(b);
 170                 for (i = 0; i < b->n_smpl; ++i) {
 171                         x = bcf_p1_call_gt(pa, pr->f_exp, i);
 172                         ((uint8_t*)b->gi[old_n_gi].data)[i] = (x&3) == 0? 1<<3|1 : (x&3) == 1? 1 : 0;
 173                         ((uint8_t*)b->gi[old_n_gi+1].data)[i] = x>>2;
 174                 }
 175         }
 176         return is_var;
 177 }
 178
 179 static char **read_samples(const char *fn, int *_n)
 180 {
 181         gzFile fp;
 182         kstream_t *ks;
 183         kstring_t s;
 184         int dret, n = 0, max = 0;
 185         char **sam = 0;
 186         *_n = 0;
 187         s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 188         fp = gzopen(fn, "r");
 189         if (fp == 0) return 0; // fail to open file
 190         ks = ks_init(fp);
 191         while (ks_getuntil(ks, 0, &s, &dret) >= 0) {
 192                 int l;
 193                 if (max == n) {
 194                         max = max? max<<1 : 4;
 195                         sam = realloc(sam, sizeof(void*)*max);
 196                 }
 197                 l = s.l;
 198                 sam[n] = malloc(s.l + 2);
 199                 strcpy(sam[n], s.s);
 200                 sam[n][l+1] = 2; // by default, diploid
 201                 if (dret != '\n') {
 202                         if (ks_getuntil(ks, 0, &s, &dret) >= 0) { // read ploidy, 1 or 2
 203                                 int x = (int)s.s[0] - '0';
 204                                 if (x == 1 || x == 2) sam[n][l+1] = x;
 205                                 else fprintf(stderr, "(%s) ploidy can only be 1 or 2; assume diploid\n", __func__);
 206                         }
 207                         if (dret != '\n') ks_getuntil(ks, '\n', &s, &dret);
 208                 }
 209                 ++n;
 210         }
 211         ks_destroy(ks);
 212         gzclose(fp);
 213         free(s.s);
 214         *_n = n;
 215         return sam;
 216 }
 217
 218 static void write_header(bcf_hdr_t *h)
 219 {
 220         kstring_t str;
 221         str.l = h->l_txt? h->l_txt - 1 : 0;
 222         str.m = str.l + 1; str.s = h->txt;
 223         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=DP,"))
 224                 kputs("##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=\"Raw read depth\">\n", &str);
 225         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=DP4,"))
 226                 kputs("##INFO=<ID=DP4,Number=4,Type=Integer,Description=\"# high-quality ref-forward bases, ref-reverse, alt-forward and alt-reverse bases\">\n", &str);
 227         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=MQ,"))
 228                 kputs("##INFO=<ID=MQ,Number=1,Type=Integer,Description=\"Root-mean-square mapping quality of covering reads\">\n", &str);
 229         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=FQ,"))
 230                 kputs("##INFO=<ID=FQ,Number=1,Type=Float,Description=\"Phred probability of all samples being the same\">\n", &str);
 231         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=AF1,"))
 232                 kputs("##INFO=<ID=AF1,Number=1,Type=Float,Description=\"Max-likelihood estimate of the site allele frequency of the first ALT allele\">\n", &str);
 233         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=G3,"))
 234                 kputs("##INFO=<ID=G3,Number=3,Type=Float,Description=\"ML estimate of genotype frequencies\">\n", &str);
 235         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=HWE,"))
 236                 kputs("##INFO=<ID=HWE,Number=1,Type=Float,Description=\"Chi^2 based HWE test P-value based on G3\">\n", &str);
 237         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=CI95,"))
 238                 kputs("##INFO=<ID=CI95,Number=2,Type=Float,Description=\"Equal-tail Bayesian credible interval of the site allele frequency at the 95% level\">\n", &str);
 239         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PV4,"))
 240                 kputs("##INFO=<ID=PV4,Number=4,Type=Float,Description=\"P-values for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias\">\n", &str);
 241     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=INDEL,"))
 242         kputs("##INFO=<ID=INDEL,Number=0,Type=Flag,Description=\"Indicates that the variant is an INDEL.\">\n", &str);
 243     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PC2,"))
 244         kputs("##INFO=<ID=PC2,Number=2,Type=Integer,Description=\"Phred probability of the nonRef allele frequency in group1 samples being larger (,smaller) than in group2.\">\n", &str);
 245     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PCHI2,"))
 246         kputs("##INFO=<ID=PCHI2,Number=1,Type=Float,Description=\"Posterior weighted chi^2 P-value for testing the association between group1 and group2 samples.\">\n", &str);
 247     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=QCHI2,"))
 248         kputs("##INFO=<ID=QCHI2,Number=1,Type=Integer,Description=\"Phred scaled PCHI2.\">\n", &str);
 249     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=RP,"))
 250         kputs("##INFO=<ID=PR,Number=1,Type=Integer,Description=\"# permutations yielding a smaller PCHI2.\">\n", &str);
 251     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GT,"))
 252         kputs("##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description=\"Genotype\">\n", &str);
 253     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GQ,"))
 254         kputs("##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description=\"Genotype Quality\">\n", &str);
 255     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GL,"))
 256         kputs("##FORMAT=<ID=GL,Number=3,Type=Float,Description=\"Likelihoods for RR,RA,AA genotypes (R=ref,A=alt)\">\n", &str);
 257         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=DP,"))
 258                 kputs("##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=\"# high-quality bases\">\n", &str);
 259         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=SP,"))
 260                 kputs("##FORMAT=<ID=SP,Number=1,Type=Integer,Description=\"Phred-scaled strand bias P-value\">\n", &str);
 261         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=PL,"))
 262                 kputs("##FORMAT=<ID=PL,Number=-1,Type=Integer,Description=\"List of Phred-scaled genotype likelihoods, number of values is (#ALT+1)*(#ALT+2)/2\">\n", &str);
 263         h->l_txt = str.l + 1; h->txt = str.s;
 264 }
 265
 266 double bcf_pair_freq(const bcf1_t *b0, const bcf1_t *b1, double f[4]);
 267
 268 int bcfview(int argc, char *argv[])
 269 {
 270         extern int bcf_2qcall(bcf_hdr_t *h, bcf1_t *b);
 271         extern void bcf_p1_indel_prior(bcf_p1aux_t *ma, double x);
 272         extern int bcf_fix_gt(bcf1_t *b);
 273         extern int bcf_anno_max(bcf1_t *b);
 274         extern int bcf_shuffle(bcf1_t *b, int seed);
 275         bcf_t *bp, *bout = 0;
 276         bcf1_t *b, *blast;
 277         int c, *seeds = 0;
 278         uint64_t n_processed = 0;
 279         viewconf_t vc;
 280         bcf_p1aux_t *p1 = 0;
 281         bcf_hdr_t *hin, *hout;
 282         int tid, begin, end;
 283         char moder[4], modew[4];
 284
 285         tid = begin = end = -1;
 286         memset(&vc, 0, sizeof(viewconf_t));
 287         vc.prior_type = vc.n1 = -1; vc.theta = 1e-3; vc.pref = 0.5; vc.indel_frac = -1.; vc.n_perm = 0; vc.min_perm_p = 0.01; vc.min_smpl_frac = 0; vc.min_lrt = 1;
 288         while ((c = getopt(argc, argv, "FN1:l:cC:eHAGvbSuP:t:p:QgLi:IMs:D:U:X:d:")) >= 0) {
 289                 switch (c) {
 290                 case '1': vc.n1 = atoi(optarg); break;
 291                 case 'l': vc.bed = bed_read(optarg); break;
 292                 case 'D': vc.fn_dict = strdup(optarg); break;
 293                 case 'F': vc.flag |= VC_FIX_PL; break;
 294                 case 'N': vc.flag |= VC_ACGT_ONLY; break;
 295                 case 'G': vc.flag |= VC_NO_GENO; break;
 296                 case 'A': vc.flag |= VC_KEEPALT; break;
 297                 case 'b': vc.flag |= VC_BCFOUT; break;
 298                 case 'S': vc.flag |= VC_VCFIN; break;
 299                 case 'c': vc.flag |= VC_CALL; break;
 300                 case 'e': vc.flag |= VC_EM; break;
 301                 case 'v': vc.flag |= VC_VARONLY | VC_CALL; break;
 302                 case 'u': vc.flag |= VC_UNCOMP | VC_BCFOUT; break;
 303                 case 'g': vc.flag |= VC_CALL_GT | VC_CALL; break;
 304                 case 'I': vc.flag |= VC_NO_INDEL; break;
 305                 case 'M': vc.flag |= VC_ANNO_MAX; break;
 306                 case 't': vc.theta = atof(optarg); break;
 307                 case 'p': vc.pref = atof(optarg); break;
 308                 case 'i': vc.indel_frac = atof(optarg); break;
 309                 case 'Q': vc.flag |= VC_QCALL; break;
 310                 case 'L': vc.flag |= VC_ADJLD; break;
 311                 case 'U': vc.n_perm = atoi(optarg); break;
 312                 case 'C': vc.min_lrt = atof(optarg); break;
 313                 case 'X': vc.min_perm_p = atof(optarg); break;
 314                 case 'd': vc.min_smpl_frac = atof(optarg); break;
 315                 case 's': vc.subsam = read_samples(optarg, &vc.n_sub);
 316                         vc.ploidy = calloc(vc.n_sub + 1, 1);
 317                         for (tid = 0; tid < vc.n_sub; ++tid) vc.ploidy[tid] = vc.subsam[tid][strlen(vc.subsam[tid]) + 1];
 318                         tid = -1;
 319                         break;
 320                 case 'P':
 321                         if (strcmp(optarg, "full") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_FULL;
 322                         else if (strcmp(optarg, "cond2") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_COND2;
 323                         else if (strcmp(optarg, "flat") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_FLAT;
 324                         else vc.prior_file = strdup(optarg);
 325                         break;
 326                 }
 327         }
 328         if (argc == optind) {
 329                 fprintf(stderr, "\n");
 330                 fprintf(stderr, "Usage: bcftools view [options] <in.bcf> [reg]\n\n");
 331                 fprintf(stderr, "Input/output options:\n\n");
 332                 fprintf(stderr, "       -A        keep all possible alternate alleles at variant sites\n");
 333                 fprintf(stderr, "       -b        output BCF instead of VCF\n");
 334                 fprintf(stderr, "       -D FILE   sequence dictionary for VCF->BCF conversion [null]\n");
 335                 fprintf(stderr, "       -F        PL generated by r921 or before (which generate old ordering)\n");
 336                 fprintf(stderr, "       -G        suppress all individual genotype information\n");
 337                 fprintf(stderr, "       -l FILE   list of sites (chr pos) or regions (BED) to output [all sites]\n");
 338                 fprintf(stderr, "       -L        calculate LD for adjacent sites\n");
 339                 fprintf(stderr, "       -N        skip sites where REF is not A/C/G/T\n");
 340                 fprintf(stderr, "       -Q        output the QCALL likelihood format\n");
 341                 fprintf(stderr, "       -s FILE   list of samples to use [all samples]\n");
 342                 fprintf(stderr, "       -S        input is VCF\n");
 343                 fprintf(stderr, "       -u        uncompressed BCF output (force -b)\n");
 344                 fprintf(stderr, "\nConsensus/variant calling options:\n\n");
 345                 fprintf(stderr, "       -c        SNP calling (force -e)\n");
 346                 fprintf(stderr, "       -d FLOAT  skip loci where less than FLOAT fraction of samples covered [0]\n");
 347                 fprintf(stderr, "       -e        likelihood based analyses\n");
 348                 fprintf(stderr, "       -g        call genotypes at variant sites (force -c)\n");
 349                 fprintf(stderr, "       -i FLOAT  indel-to-substitution ratio [%.4g]\n", vc.indel_frac);
 350                 fprintf(stderr, "       -I        skip indels\n");
 351                 fprintf(stderr, "       -p FLOAT  variant if P(ref|D)<FLOAT [%.3g]\n", vc.pref);
 352                 fprintf(stderr, "       -P STR    type of prior: full, cond2, flat [full]\n");
 353                 fprintf(stderr, "       -t FLOAT  scaled substitution mutation rate [%.4g]\n", vc.theta);
 354                 fprintf(stderr, "       -v        output potential variant sites only (force -c)\n");
 355                 fprintf(stderr, "\nContrast calling and association test options:\n\n");
 356                 fprintf(stderr, "       -1 INT    number of group-1 samples [0]\n");
 357                 fprintf(stderr, "       -C FLOAT  posterior constrast for LRT<FLOAT and P(ref|D)<0.5 [%g]\n", vc.min_lrt);
 358                 fprintf(stderr, "       -U INT    number of permutations for association testing (effective with -1) [0]\n");
 359                 fprintf(stderr, "       -X FLOAT  only perform permutations for P(chi^2)<FLOAT [%g]\n", vc.min_perm_p);
 360                 fprintf(stderr, "\n");
 361                 return 1;
 362         }
 363
 364         if (vc.flag & VC_CALL) vc.flag |= VC_EM;
 365         if ((vc.flag & VC_VCFIN) && (vc.flag & VC_BCFOUT) && vc.fn_dict == 0) {
 366                 fprintf(stderr, "[%s] For VCF->BCF conversion please specify the sequence dictionary with -D\n", __func__);
 367                 return 1;
 368         }
 369         if (vc.n1 <= 0) vc.n_perm = 0; // TODO: give a warning here!
 370         if (vc.n_perm > 0) {
 371                 seeds = malloc(vc.n_perm * sizeof(int));
 372                 srand48(time(0));
 373                 for (c = 0; c < vc.n_perm; ++c) seeds[c] = lrand48();
 374         }
 375         b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 376         blast = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 377         strcpy(moder, "r");
 378         if (!(vc.flag & VC_VCFIN)) strcat(moder, "b");
 379         strcpy(modew, "w");
 380         if (vc.flag & VC_BCFOUT) strcat(modew, "b");
 381         if (vc.flag & VC_UNCOMP) strcat(modew, "u");
 382         bp = vcf_open(argv[optind], moder);
 383         hin = hout = vcf_hdr_read(bp);
 384         if (vc.fn_dict && (vc.flag & VC_VCFIN))
 385                 vcf_dictread(bp, hin, vc.fn_dict);
 386         bout = vcf_open("-", modew);
 387         if (!(vc.flag & VC_QCALL)) {
 388                 if (vc.n_sub) {
 389                         vc.sublist = calloc(vc.n_sub, sizeof(int));
 390                         hout = bcf_hdr_subsam(hin, vc.n_sub, vc.subsam, vc.sublist);
 391                 }
 392                 if (vc.flag & VC_CALL) write_header(hout);
 393                 vcf_hdr_write(bout, hout);
 394         }
 395         if (vc.flag & VC_CALL) {
 396                 p1 = bcf_p1_init(hout->n_smpl, vc.ploidy);
 397                 if (vc.prior_file) {
 398                         if (bcf_p1_read_prior(p1, vc.prior_file) < 0) {
 399                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to read the prior AFS.\n", __func__);
 400                                 return 1;
 401                         }
 402                 } else bcf_p1_init_prior(p1, vc.prior_type, vc.theta);
 403                 if (vc.n1 > 0 && vc.min_lrt > 0.) { // set n1
 404                         bcf_p1_set_n1(p1, vc.n1);
 405                         bcf_p1_init_subprior(p1, vc.prior_type, vc.theta);
 406                 }
 407                 if (vc.indel_frac > 0.) bcf_p1_indel_prior(p1, vc.indel_frac); // otherwise use the default indel_frac
 408         }
 409         if (optind + 1 < argc && !(vc.flag&VC_VCFIN)) {
 410                 void *str2id = bcf_build_refhash(hout);
 411                 if (bcf_parse_region(str2id, argv[optind+1], &tid, &begin, &end) >= 0) {
 412                         bcf_idx_t *idx;
 413                         idx = bcf_idx_load(argv[optind]);
 414                         if (idx) {
 415                                 uint64_t off;
 416                                 off = bcf_idx_query(idx, tid, begin);
 417                                 if (off == 0) {
 418                                         fprintf(stderr, "[%s] no records in the query region.\n", __func__);
 419                                         return 1; // FIXME: a lot of memory leaks...
 420                                 }
 421                                 bgzf_seek(bp->fp, off, SEEK_SET);
 422                                 bcf_idx_destroy(idx);
 423                         }
 424                 }
 425         }
 426         while (vcf_read(bp, hin, b) > 0) {
 427                 int is_indel;
 428                 double em[9];
 429                 if ((vc.flag & VC_VARONLY) && strcmp(b->alt, "X") == 0) continue;
 430                 if ((vc.flag & VC_VARONLY) && vc.min_smpl_frac > 0.) {
 431                         extern int bcf_smpl_covered(const bcf1_t *b);
 432                         int n = bcf_smpl_covered(b);
 433                         if ((double)n / b->n_smpl < vc.min_smpl_frac) continue;
 434                 }
 435                 if (vc.n_sub) bcf_subsam(vc.n_sub, vc.sublist, b);
 436                 if (vc.flag & VC_FIX_PL) bcf_fix_pl(b);
 437                 is_indel = bcf_is_indel(b);
 438                 if ((vc.flag & VC_NO_INDEL) && is_indel) continue;
 439                 if ((vc.flag & VC_ACGT_ONLY) && !is_indel) {
 440                         int x;
 441                         if (b->ref[0] == 0 || b->ref[1] != 0) continue;
 442                         x = toupper(b->ref[0]);
 443                         if (x != 'A' && x != 'C' && x != 'G' && x != 'T') continue;
 444                 }
 445                 if (vc.bed && !bed_overlap(vc.bed, hin->ns[b->tid], b->pos, b->pos + strlen(b->ref))) continue;
 446                 if (tid >= 0) {
 447                         int l = strlen(b->ref);
 448                         l = b->pos + (l > 0? l : 1);
 449                         if (b->tid != tid || b->pos >= end) break;
 450                         if (!(l > begin && end > b->pos)) continue;
 451                 }
 452                 ++n_processed;
 453                 if (vc.flag & VC_QCALL) { // output QCALL format; STOP here
 454                         bcf_2qcall(hout, b);
 455                         continue;
 456                 }
 457                 if (vc.flag & VC_EM) bcf_em1(b, vc.n1, 0xff, em);
 458                 else {
 459                         int i;
 460                         for (i = 0; i < 9; ++i) em[i] = -1.;
 461                 }
 462                 if (vc.flag & (VC_CALL|VC_ADJLD)) bcf_gl2pl(b);
 463                 if (vc.flag & VC_CALL) { // call variants
 464                         bcf_p1rst_t pr;
 465                         int calret = bcf_p1_cal(b, (em[7] >= 0 && em[7] < vc.min_lrt), p1, &pr);
 466                         if (n_processed % 100000 == 0) {
 467                                 fprintf(stderr, "[%s] %ld sites processed.\n", __func__, (long)n_processed);
 468                                 bcf_p1_dump_afs(p1);
 469                         }
 470                         if (pr.p_ref >= vc.pref && (vc.flag & VC_VARONLY)) continue;
 471                         if (vc.n_perm && vc.n1 > 0 && pr.p_chi2 < vc.min_perm_p) { // permutation test
 472                                 bcf_p1rst_t r;
 473                                 int i, n = 0;
 474                                 for (i = 0; i < vc.n_perm; ++i) {
 475 #ifdef BCF_PERM_LRT // LRT based permutation is much faster but less robust to artifacts
 476                                         double x[9];
 477                                         bcf_shuffle(b, seeds[i]);
 478                                         bcf_em1(b, vc.n1, 1<<7, x);
 479                                         if (x[7] < em[7]) ++n;
 480 #else
 481                                         bcf_shuffle(b, seeds[i]);
 482                                         bcf_p1_cal(b, 1, p1, &r);
 483                                         if (pr.p_chi2 >= r.p_chi2) ++n;
 484 #endif
 485                                 }
 486                                 pr.perm_rank = n;
 487                         }
 488                         if (calret >= 0) update_bcf1(b, p1, &pr, vc.pref, vc.flag, em);
 489                 } else if (vc.flag & VC_EM) update_bcf1(b, 0, 0, 0, vc.flag, em);
 490                 if (vc.flag & VC_ADJLD) { // compute LD
 491                         double f[4], r2;
 492                         if ((r2 = bcf_pair_freq(blast, b, f)) >= 0) {
 493                                 kstring_t s;
 494                                 s.m = s.l = 0; s.s = 0;
 495                                 if (*b->info) kputc(';', &s);
 496                                 ksprintf(&s, "NEIR=%.3f;NEIF4=%.3f,%.3f,%.3f,%.3f", r2, f[0], f[1], f[2], f[3]);
 497                                 bcf_append_info(b, s.s, s.l);
 498                                 free(s.s);
 499                         }
 500                         bcf_cpy(blast, b);
 501                 }
 502                 if (vc.flag & VC_ANNO_MAX) bcf_anno_max(b);
 503                 if (vc.flag & VC_NO_GENO) { // do not output GENO fields
 504                         b->n_gi = 0;
 505                         b->fmt[0] = '\0';
 506                         b->l_str = b->fmt - b->str + 1;
 507                 } else bcf_fix_gt(b);
 508                 vcf_write(bout, hout, b);
 509         }
 510         if (vc.prior_file) free(vc.prior_file);
 511         if (vc.flag & VC_CALL) bcf_p1_dump_afs(p1);
 512         if (hin != hout) bcf_hdr_destroy(hout);
 513         bcf_hdr_destroy(hin);
 514         bcf_destroy(b); bcf_destroy(blast);
 515         vcf_close(bp); vcf_close(bout);
 516         if (vc.fn_dict) free(vc.fn_dict);
 517         if (vc.ploidy) free(vc.ploidy);
 518         if (vc.n_sub) {
 519                 int i;
 520                 for (i = 0; i < vc.n_sub; ++i) free(vc.subsam[i]);
 521                 free(vc.subsam); free(vc.sublist);
 522         }
 523         if (vc.bed) bed_destroy(vc.bed);
 524         if (seeds) free(seeds);
 525         if (p1) bcf_p1_destroy(p1);
 526         return 0;
 527 }