bcftools/call1.c

   1 #include <unistd.h>
   2 #include <stdlib.h>
   3 #include <math.h>
   4 #include <zlib.h>
   5 #include <errno.h>
   6 #include "bcf.h"
   7 #include "prob1.h"
   8 #include "kstring.h"
   9 #include "time.h"
  10
  11 #include "kseq.h"
  12 KSTREAM_INIT(gzFile, gzread, 16384)
  13
  14 #define VC_NO_GENO 2
  15 #define VC_BCFOUT  4
  16 #define VC_CALL    8
  17 #define VC_VARONLY 16
  18 #define VC_VCFIN   32
  19 #define VC_UNCOMP  64
  20 #define VC_KEEPALT 256
  21 #define VC_ACGT_ONLY 512
  22 #define VC_QCALL   1024
  23 #define VC_CALL_GT 2048
  24 #define VC_ADJLD   4096
  25 #define VC_NO_INDEL 8192
  26 #define VC_ANNO_MAX 16384
  27 #define VC_FIX_PL   32768
  28 #define VC_EM       0x10000
  29 #define VC_PAIRCALL 0x20000
  30 #define VC_QCNT     0x40000
  31
  32 typedef struct {
  33         int flag, prior_type, n1, n_sub, *sublist, n_perm;
  34         uint32_t *trio_aux;
  35         char *prior_file, **subsam, *fn_dict;
  36         uint8_t *ploidy;
  37         double theta, pref, indel_frac, min_perm_p, min_smpl_frac, min_lrt;
  38         void *bed;
  39 } viewconf_t;
  40
  41 void *bed_read(const char *fn);
  42 void bed_destroy(void *_h);
  43 int bed_overlap(const void *_h, const char *chr, int beg, int end);
  44
  45 typedef struct {
  46         double p[4];
  47         int mq, depth, is_tested, d[4];
  48 } anno16_t;
  49
  50 static double ttest(int n1, int n2, int a[4])
  51 {
  52         extern double kf_betai(double a, double b, double x);
  53         double t, v, u1, u2;
  54         if (n1 == 0 || n2 == 0 || n1 + n2 < 3) return 1.0;
  55         u1 = (double)a[0] / n1; u2 = (double)a[2] / n2;
  56         if (u1 <= u2) return 1.;
  57         t = (u1 - u2) / sqrt(((a[1] - n1 * u1 * u1) + (a[3] - n2 * u2 * u2)) / (n1 + n2 - 2) * (1./n1 + 1./n2));
  58         v = n1 + n2 - 2;
  59 //      printf("%d,%d,%d,%d,%lf,%lf,%lf\n", a[0], a[1], a[2], a[3], t, u1, u2);
  60         return t < 0.? 1. : .5 * kf_betai(.5*v, .5, v/(v+t*t));
  61 }
  62
  63 static int test16_core(int anno[16], anno16_t *a)
  64 {
  65         extern double kt_fisher_exact(int n11, int n12, int n21, int n22, double *_left, double *_right, double *two);
  66         double left, right;
  67         int i;
  68         a->p[0] = a->p[1] = a->p[2] = a->p[3] = 1.;
  69         memcpy(a->d, anno, 4 * sizeof(int));
  70         a->depth = anno[0] + anno[1] + anno[2] + anno[3];
  71         a->is_tested = (anno[0] + anno[1] > 0 && anno[2] + anno[3] > 0);
  72         if (a->depth == 0) return -1;
  73         a->mq = (int)(sqrt((anno[9] + anno[11]) / a->depth) + .499);
  74         kt_fisher_exact(anno[0], anno[1], anno[2], anno[3], &left, &right, &a->p[0]);
  75         for (i = 1; i < 4; ++i)
  76                 a->p[i] = ttest(anno[0] + anno[1], anno[2] + anno[3], anno+4*i);
  77         return 0;
  78 }
  79
  80 static int test16(bcf1_t *b, anno16_t *a)
  81 {
  82         char *p;
  83         int i, anno[16];
  84         a->p[0] = a->p[1] = a->p[2] = a->p[3] = 1.;
  85         a->d[0] = a->d[1] = a->d[2] = a->d[3] = 0.;
  86         a->mq = a->depth = a->is_tested = 0;
  87         if ((p = strstr(b->info, "I16=")) == 0) return -1;
  88         p += 4;
  89         for (i = 0; i < 16; ++i) {
  90                 errno = 0; anno[i] = strtol(p, &p, 10);
  91                 if (anno[i] == 0 && (errno == EINVAL || errno == ERANGE)) return -2;
  92                 ++p;
  93         }
  94         return test16_core(anno, a);
  95 }
  96
  97 static void rm_info(bcf1_t *b, const char *key)
  98 {
  99         char *p, *q;
 100         if ((p = strstr(b->info, key)) == 0) return;
 101         for (q = p; *q && *q != ';'; ++q);
 102         if (p > b->info && *(p-1) == ';') --p;
 103         memmove(p, q, b->l_str - (q - b->str));
 104         b->l_str -= q - p;
 105         bcf_sync(b);
 106 }
 107
 108 static int update_bcf1(bcf1_t *b, const bcf_p1aux_t *pa, const bcf_p1rst_t *pr, double pref, int flag, double em[10], int cons_llr, int64_t cons_gt)
 109 {
 110         kstring_t s;
 111         int has_I16, is_var;
 112         double fq, r;
 113         anno16_t a;
 114
 115         has_I16 = test16(b, &a) >= 0? 1 : 0;
 116         rm_info(b, "I16="); // FIXME: probably this function has a bug. If I move it below, I16 will not be removed!
 117
 118         memset(&s, 0, sizeof(kstring_t));
 119         kputc('\0', &s); kputs(b->ref, &s); kputc('\0', &s);
 120         kputs(b->alt, &s); kputc('\0', &s); kputc('\0', &s);
 121         kputs(b->info, &s);
 122         if (b->info[0]) kputc(';', &s);
 123         { // print EM
 124                 if (em[0] >= 0) ksprintf(&s, "AF1=%.4g", 1 - em[0]);
 125                 if (em[4] >= 0 && em[4] <= 0.05) ksprintf(&s, ";G3=%.4g,%.4g,%.4g;HWE=%.3g", em[3], em[2], em[1], em[4]);
 126                 if (em[5] >= 0 && em[6] >= 0) ksprintf(&s, ";AF2=%.4g,%.4g", 1 - em[5], 1 - em[6]);
 127                 if (em[7] >= 0) ksprintf(&s, ";LRT=%.3g", em[7]);
 128                 if (em[8] >= 0) ksprintf(&s, ";LRT2=%.3g", em[8]);
 129                 //if (em[9] >= 0) ksprintf(&s, ";LRT1=%.3g", em[9]);
 130         }
 131         if (cons_llr > 0) {
 132                 ksprintf(&s, ";CLR=%d", cons_llr);
 133                 if (cons_gt > 0)
 134                         ksprintf(&s, ";UGT=%c%c%c;CGT=%c%c%c", cons_gt&0xff, cons_gt>>8&0xff, cons_gt>>16&0xff,
 135                                      cons_gt>>32&0xff, cons_gt>>40&0xff, cons_gt>>48&0xff);
 136         }
 137         if (pr == 0) { // if pr is unset, return
 138                 kputc('\0', &s); kputs(b->fmt, &s); kputc('\0', &s);
 139                 free(b->str);
 140                 b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 141                 bcf_sync(b);
 142                 return 1;
 143         }
 144
 145         is_var = (pr->p_ref < pref);
 146         r = is_var? pr->p_ref : pr->p_var;
 147
 148 //      ksprintf(&s, ";CI95=%.4g,%.4g", pr->cil, pr->cih); // FIXME: when EM is not used, ";" should be omitted!
 149         ksprintf(&s, ";AC1=%d", pr->ac);
 150         if (has_I16) ksprintf(&s, ";DP4=%d,%d,%d,%d;MQ=%d", a.d[0], a.d[1], a.d[2], a.d[3], a.mq);
 151         fq = pr->p_ref_folded < 0.5? -4.343 * log(pr->p_ref_folded) : 4.343 * log(pr->p_var_folded);
 152         if (fq < -999) fq = -999;
 153         if (fq > 999) fq = 999;
 154         ksprintf(&s, ";FQ=%.3g", fq);
 155         if (pr->cmp[0] >= 0.) { // two sample groups
 156                 int i, q[3];
 157                 for (i = 1; i < 3; ++i) {
 158                         double x = pr->cmp[i] + pr->cmp[0]/2.;
 159                         q[i] = x == 0? 255 : (int)(-4.343 * log(x) + .499);
 160                         if (q[i] > 255) q[i] = 255;
 161                 }
 162                 if (pr->perm_rank >= 0) ksprintf(&s, ";PR=%d", pr->perm_rank);
 163                 // ksprintf(&s, ";LRT3=%.3g", pr->lrt);
 164                 ksprintf(&s, ";PCHI2=%.3g;PC2=%d,%d", q[1], q[2], pr->p_chi2);
 165         }
 166         if (has_I16 && a.is_tested) ksprintf(&s, ";PV4=%.2g,%.2g,%.2g,%.2g", a.p[0], a.p[1], a.p[2], a.p[3]);
 167         kputc('\0', &s);
 168         kputs(b->fmt, &s); kputc('\0', &s);
 169         free(b->str);
 170         b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 171         b->qual = r < 1e-100? 999 : -4.343 * log(r);
 172         if (b->qual > 999) b->qual = 999;
 173         bcf_sync(b);
 174         if (!is_var) bcf_shrink_alt(b, 1);
 175         else if (!(flag&VC_KEEPALT))
 176                 bcf_shrink_alt(b, pr->rank0 < 2? 2 : pr->rank0+1);
 177         if (is_var && (flag&VC_CALL_GT)) { // call individual genotype
 178                 int i, x, old_n_gi = b->n_gi;
 179                 s.m = b->m_str; s.l = b->l_str - 1; s.s = b->str;
 180                 kputs(":GT:GQ", &s); kputc('\0', &s);
 181                 b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 182                 bcf_sync(b);
 183                 for (i = 0; i < b->n_smpl; ++i) {
 184                         x = bcf_p1_call_gt(pa, pr->f_exp, i);
 185                         ((uint8_t*)b->gi[old_n_gi].data)[i] = (x&3) == 0? 1<<3|1 : (x&3) == 1? 1 : 0;
 186                         ((uint8_t*)b->gi[old_n_gi+1].data)[i] = x>>2;
 187                 }
 188         }
 189         return is_var;
 190 }
 191
 192 static char **read_samples(const char *fn, int *_n)
 193 {
 194         gzFile fp;
 195         kstream_t *ks;
 196         kstring_t s;
 197         int dret, n = 0, max = 0;
 198         char **sam = 0;
 199         *_n = 0;
 200         s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 201         fp = gzopen(fn, "r");
 202         if (fp == 0) return 0; // fail to open file
 203         ks = ks_init(fp);
 204         while (ks_getuntil(ks, 0, &s, &dret) >= 0) {
 205                 int l;
 206                 if (max == n) {
 207                         max = max? max<<1 : 4;
 208                         sam = realloc(sam, sizeof(void*)*max);
 209                 }
 210                 l = s.l;
 211                 sam[n] = malloc(s.l + 2);
 212                 strcpy(sam[n], s.s);
 213                 sam[n][l+1] = 2; // by default, diploid
 214                 if (dret != '\n') {
 215                         if (ks_getuntil(ks, 0, &s, &dret) >= 0) { // read ploidy, 1 or 2
 216                                 int x = (int)s.s[0] - '0';
 217                                 if (x == 1 || x == 2) sam[n][l+1] = x;
 218                                 else fprintf(stderr, "(%s) ploidy can only be 1 or 2; assume diploid\n", __func__);
 219                         }
 220                         if (dret != '\n') ks_getuntil(ks, '\n', &s, &dret);
 221                 }
 222                 ++n;
 223         }
 224         ks_destroy(ks);
 225         gzclose(fp);
 226         free(s.s);
 227         *_n = n;
 228         return sam;
 229 }
 230
 231 static void write_header(bcf_hdr_t *h)
 232 {
 233         kstring_t str;
 234         str.l = h->l_txt? h->l_txt - 1 : 0;
 235         str.m = str.l + 1; str.s = h->txt;
 236         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=DP,"))
 237                 kputs("##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=\"Raw read depth\">\n", &str);
 238         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=DP4,"))
 239                 kputs("##INFO=<ID=DP4,Number=4,Type=Integer,Description=\"# high-quality ref-forward bases, ref-reverse, alt-forward and alt-reverse bases\">\n", &str);
 240         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=MQ,"))
 241                 kputs("##INFO=<ID=MQ,Number=1,Type=Integer,Description=\"Root-mean-square mapping quality of covering reads\">\n", &str);
 242         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=FQ,"))
 243                 kputs("##INFO=<ID=FQ,Number=1,Type=Float,Description=\"Phred probability of all samples being the same\">\n", &str);
 244         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=AF1,"))
 245                 kputs("##INFO=<ID=AF1,Number=1,Type=Float,Description=\"Max-likelihood estimate of the first ALT allele frequency (assuming HWE)\">\n", &str);
 246         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=AC1,"))
 247                 kputs("##INFO=<ID=AC1,Number=1,Type=Float,Description=\"Max-likelihood estimate of the first ALT allele count (no HWE assumption)\">\n", &str);
 248         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=G3,"))
 249                 kputs("##INFO=<ID=G3,Number=3,Type=Float,Description=\"ML estimate of genotype frequencies\">\n", &str);
 250         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=HWE,"))
 251                 kputs("##INFO=<ID=HWE,Number=1,Type=Float,Description=\"Chi^2 based HWE test P-value based on G3\">\n", &str);
 252         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=CLR,"))
 253                 kputs("##INFO=<ID=CLR,Number=1,Type=Integer,Description=\"Log ratio of genotype likelihoods with and without the constraint\">\n", &str);
 254         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=UGT,"))
 255                 kputs("##INFO=<ID=UGT,Number=1,Type=String,Description=\"The most probable unconstrained genotype configuration in the trio\">\n", &str);
 256         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=CGT,"))
 257                 kputs("##INFO=<ID=CGT,Number=1,Type=String,Description=\"The most probable constrained genotype configuration in the trio\">\n", &str);
 258 //      if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=CI95,"))
 259 //              kputs("##INFO=<ID=CI95,Number=2,Type=Float,Description=\"Equal-tail Bayesian credible interval of the site allele frequency at the 95% level\">\n", &str);
 260         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PV4,"))
 261                 kputs("##INFO=<ID=PV4,Number=4,Type=Float,Description=\"P-values for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias\">\n", &str);
 262     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=INDEL,"))
 263         kputs("##INFO=<ID=INDEL,Number=0,Type=Flag,Description=\"Indicates that the variant is an INDEL.\">\n", &str);
 264     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PC2,"))
 265         kputs("##INFO=<ID=PC2,Number=2,Type=Integer,Description=\"Phred probability of the nonRef allele frequency in group1 samples being larger (,smaller) than in group2.\">\n", &str);
 266     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PCHI2,"))
 267         kputs("##INFO=<ID=PCHI2,Number=1,Type=Float,Description=\"Posterior weighted chi^2 P-value for testing the association between group1 and group2 samples.\">\n", &str);
 268     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=QCHI2,"))
 269         kputs("##INFO=<ID=QCHI2,Number=1,Type=Integer,Description=\"Phred scaled PCHI2.\">\n", &str);
 270     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=RP,"))
 271         kputs("##INFO=<ID=PR,Number=1,Type=Integer,Description=\"# permutations yielding a smaller PCHI2.\">\n", &str);
 272     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GT,"))
 273         kputs("##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description=\"Genotype\">\n", &str);
 274     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GQ,"))
 275         kputs("##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description=\"Genotype Quality\">\n", &str);
 276     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GL,"))
 277         kputs("##FORMAT=<ID=GL,Number=3,Type=Float,Description=\"Likelihoods for RR,RA,AA genotypes (R=ref,A=alt)\">\n", &str);
 278         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=DP,"))
 279                 kputs("##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=\"# high-quality bases\">\n", &str);
 280         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=SP,"))
 281                 kputs("##FORMAT=<ID=SP,Number=1,Type=Integer,Description=\"Phred-scaled strand bias P-value\">\n", &str);
 282         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=PL,"))
 283                 kputs("##FORMAT=<ID=PL,Number=-1,Type=Integer,Description=\"List of Phred-scaled genotype likelihoods, number of values is (#ALT+1)*(#ALT+2)/2\">\n", &str);
 284         h->l_txt = str.l + 1; h->txt = str.s;
 285 }
 286
 287 double bcf_pair_freq(const bcf1_t *b0, const bcf1_t *b1, double f[4]);
 288
 289 int bcfview(int argc, char *argv[])
 290 {
 291         extern int bcf_2qcall(bcf_hdr_t *h, bcf1_t *b);
 292         extern void bcf_p1_indel_prior(bcf_p1aux_t *ma, double x);
 293         extern int bcf_fix_gt(bcf1_t *b);
 294         extern int bcf_anno_max(bcf1_t *b);
 295         extern int bcf_shuffle(bcf1_t *b, int seed);
 296         extern uint32_t *bcf_trio_prep(int is_x, int is_son);
 297         extern int bcf_trio_call(uint32_t *prep, const bcf1_t *b, int *llr, int64_t *gt);
 298         extern int bcf_pair_call(const bcf1_t *b);
 299         extern int bcf_min_diff(const bcf1_t *b);
 300
 301         bcf_t *bp, *bout = 0;
 302         bcf1_t *b, *blast;
 303         int c, *seeds = 0;
 304         uint64_t n_processed = 0, qcnt[256];
 305         viewconf_t vc;
 306         bcf_p1aux_t *p1 = 0;
 307         bcf_hdr_t *hin, *hout;
 308         int tid, begin, end;
 309         char moder[4], modew[4];
 310
 311         tid = begin = end = -1;
 312         memset(&vc, 0, sizeof(viewconf_t));
 313         vc.prior_type = vc.n1 = -1; vc.theta = 1e-3; vc.pref = 0.5; vc.indel_frac = -1.; vc.n_perm = 0; vc.min_perm_p = 0.01; vc.min_smpl_frac = 0; vc.min_lrt = 1;
 314         memset(qcnt, 0, 8 * 256);
 315         while ((c = getopt(argc, argv, "FN1:l:cC:eHAGvbSuP:t:p:QgLi:IMs:D:U:X:d:T:Y")) >= 0) {
 316                 switch (c) {
 317                 case '1': vc.n1 = atoi(optarg); break;
 318                 case 'l': vc.bed = bed_read(optarg); break;
 319                 case 'D': vc.fn_dict = strdup(optarg); break;
 320                 case 'F': vc.flag |= VC_FIX_PL; break;
 321                 case 'N': vc.flag |= VC_ACGT_ONLY; break;
 322                 case 'G': vc.flag |= VC_NO_GENO; break;
 323                 case 'A': vc.flag |= VC_KEEPALT; break;
 324                 case 'b': vc.flag |= VC_BCFOUT; break;
 325                 case 'S': vc.flag |= VC_VCFIN; break;
 326                 case 'c': vc.flag |= VC_CALL; break;
 327                 case 'e': vc.flag |= VC_EM; break;
 328                 case 'v': vc.flag |= VC_VARONLY | VC_CALL; break;
 329                 case 'u': vc.flag |= VC_UNCOMP | VC_BCFOUT; break;
 330                 case 'g': vc.flag |= VC_CALL_GT | VC_CALL; break;
 331                 case 'I': vc.flag |= VC_NO_INDEL; break;
 332                 case 'M': vc.flag |= VC_ANNO_MAX; break;
 333                 case 'Y': vc.flag |= VC_QCNT; break;
 334                 case 't': vc.theta = atof(optarg); break;
 335                 case 'p': vc.pref = atof(optarg); break;
 336                 case 'i': vc.indel_frac = atof(optarg); break;
 337                 case 'Q': vc.flag |= VC_QCALL; break;
 338                 case 'L': vc.flag |= VC_ADJLD; break;
 339                 case 'U': vc.n_perm = atoi(optarg); break;
 340                 case 'C': vc.min_lrt = atof(optarg); break;
 341                 case 'X': vc.min_perm_p = atof(optarg); break;
 342                 case 'd': vc.min_smpl_frac = atof(optarg); break;
 343                 case 's': vc.subsam = read_samples(optarg, &vc.n_sub);
 344                         vc.ploidy = calloc(vc.n_sub + 1, 1);
 345                         for (tid = 0; tid < vc.n_sub; ++tid) vc.ploidy[tid] = vc.subsam[tid][strlen(vc.subsam[tid]) + 1];
 346                         tid = -1;
 347                         break;
 348                 case 'T':
 349                         if (strcmp(optarg, "trioauto") == 0) vc.trio_aux = bcf_trio_prep(0, 0);
 350                         else if (strcmp(optarg, "trioxd") == 0) vc.trio_aux = bcf_trio_prep(1, 0);
 351                         else if (strcmp(optarg, "trioxs") == 0) vc.trio_aux = bcf_trio_prep(1, 1);
 352                         else if (strcmp(optarg, "pair") == 0) vc.flag |= VC_PAIRCALL;
 353                         else {
 354                                 fprintf(stderr, "[%s] Option '-T' can only take value trioauto, trioxd or trioxs.\n", __func__);
 355                                 return 1;
 356                         }
 357                         break;
 358                 case 'P':
 359                         if (strcmp(optarg, "full") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_FULL;
 360                         else if (strcmp(optarg, "cond2") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_COND2;
 361                         else if (strcmp(optarg, "flat") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_FLAT;
 362                         else vc.prior_file = strdup(optarg);
 363                         break;
 364                 }
 365         }
 366         if (argc == optind) {
 367                 fprintf(stderr, "\n");
 368                 fprintf(stderr, "Usage: bcftools view [options] <in.bcf> [reg]\n\n");
 369                 fprintf(stderr, "Input/output options:\n\n");
 370                 fprintf(stderr, "       -A        keep all possible alternate alleles at variant sites\n");
 371                 fprintf(stderr, "       -b        output BCF instead of VCF\n");
 372                 fprintf(stderr, "       -D FILE   sequence dictionary for VCF->BCF conversion [null]\n");
 373                 fprintf(stderr, "       -F        PL generated by r921 or before (which generate old ordering)\n");
 374                 fprintf(stderr, "       -G        suppress all individual genotype information\n");
 375                 fprintf(stderr, "       -l FILE   list of sites (chr pos) or regions (BED) to output [all sites]\n");
 376                 fprintf(stderr, "       -L        calculate LD for adjacent sites\n");
 377                 fprintf(stderr, "       -N        skip sites where REF is not A/C/G/T\n");
 378                 fprintf(stderr, "       -Q        output the QCALL likelihood format\n");
 379                 fprintf(stderr, "       -s FILE   list of samples to use [all samples]\n");
 380                 fprintf(stderr, "       -S        input is VCF\n");
 381                 fprintf(stderr, "       -u        uncompressed BCF output (force -b)\n");
 382                 fprintf(stderr, "\nConsensus/variant calling options:\n\n");
 383                 fprintf(stderr, "       -c        SNP calling (force -e)\n");
 384                 fprintf(stderr, "       -d FLOAT  skip loci where less than FLOAT fraction of samples covered [0]\n");
 385                 fprintf(stderr, "       -e        likelihood based analyses\n");
 386                 fprintf(stderr, "       -g        call genotypes at variant sites (force -c)\n");
 387                 fprintf(stderr, "       -i FLOAT  indel-to-substitution ratio [%.4g]\n", vc.indel_frac);
 388                 fprintf(stderr, "       -I        skip indels\n");
 389                 fprintf(stderr, "       -p FLOAT  variant if P(ref|D)<FLOAT [%.3g]\n", vc.pref);
 390                 fprintf(stderr, "       -P STR    type of prior: full, cond2, flat [full]\n");
 391                 fprintf(stderr, "       -t FLOAT  scaled substitution mutation rate [%.4g]\n", vc.theta);
 392                 fprintf(stderr, "       -T STR    constrained calling; STR can be: pair, trioauto, trioxd and trioxs (see manual) [null]\n");
 393                 fprintf(stderr, "       -v        output potential variant sites only (force -c)\n");
 394                 fprintf(stderr, "\nContrast calling and association test options:\n\n");
 395                 fprintf(stderr, "       -1 INT    number of group-1 samples [0]\n");
 396                 fprintf(stderr, "       -C FLOAT  posterior constrast for LRT<FLOAT and P(ref|D)<0.5 [%g]\n", vc.min_lrt);
 397                 fprintf(stderr, "       -U INT    number of permutations for association testing (effective with -1) [0]\n");
 398                 fprintf(stderr, "       -X FLOAT  only perform permutations for P(chi^2)<FLOAT [%g]\n", vc.min_perm_p);
 399                 fprintf(stderr, "\n");
 400                 return 1;
 401         }
 402
 403         if (vc.flag & VC_CALL) vc.flag |= VC_EM;
 404         if ((vc.flag & VC_VCFIN) && (vc.flag & VC_BCFOUT) && vc.fn_dict == 0) {
 405                 fprintf(stderr, "[%s] For VCF->BCF conversion please specify the sequence dictionary with -D\n", __func__);
 406                 return 1;
 407         }
 408         if (vc.n1 <= 0) vc.n_perm = 0; // TODO: give a warning here!
 409         if (vc.n_perm > 0) {
 410                 seeds = malloc(vc.n_perm * sizeof(int));
 411                 srand48(time(0));
 412                 for (c = 0; c < vc.n_perm; ++c) seeds[c] = lrand48();
 413         }
 414         b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 415         blast = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 416         strcpy(moder, "r");
 417         if (!(vc.flag & VC_VCFIN)) strcat(moder, "b");
 418         strcpy(modew, "w");
 419         if (vc.flag & VC_BCFOUT) strcat(modew, "b");
 420         if (vc.flag & VC_UNCOMP) strcat(modew, "u");
 421         bp = vcf_open(argv[optind], moder);
 422         hin = hout = vcf_hdr_read(bp);
 423         if (vc.fn_dict && (vc.flag & VC_VCFIN))
 424                 vcf_dictread(bp, hin, vc.fn_dict);
 425         bout = vcf_open("-", modew);
 426         if (!(vc.flag & VC_QCALL)) {
 427                 if (vc.n_sub) {
 428                         vc.sublist = calloc(vc.n_sub, sizeof(int));
 429                         hout = bcf_hdr_subsam(hin, vc.n_sub, vc.subsam, vc.sublist);
 430                 }
 431                 if (vc.flag & VC_CALL) write_header(hout);
 432                 vcf_hdr_write(bout, hout);
 433         }
 434         if (vc.flag & VC_CALL) {
 435                 p1 = bcf_p1_init(hout->n_smpl, vc.ploidy);
 436                 if (vc.prior_file) {
 437                         if (bcf_p1_read_prior(p1, vc.prior_file) < 0) {
 438                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to read the prior AFS.\n", __func__);
 439                                 return 1;
 440                         }
 441                 } else bcf_p1_init_prior(p1, vc.prior_type, vc.theta);
 442                 if (vc.n1 > 0 && vc.min_lrt > 0.) { // set n1
 443                         bcf_p1_set_n1(p1, vc.n1);
 444                         bcf_p1_init_subprior(p1, vc.prior_type, vc.theta);
 445                 }
 446                 if (vc.indel_frac > 0.) bcf_p1_indel_prior(p1, vc.indel_frac); // otherwise use the default indel_frac
 447         }
 448         if (optind + 1 < argc && !(vc.flag&VC_VCFIN)) {
 449                 void *str2id = bcf_build_refhash(hout);
 450                 if (bcf_parse_region(str2id, argv[optind+1], &tid, &begin, &end) >= 0) {
 451                         bcf_idx_t *idx;
 452                         idx = bcf_idx_load(argv[optind]);
 453                         if (idx) {
 454                                 uint64_t off;
 455                                 off = bcf_idx_query(idx, tid, begin);
 456                                 if (off == 0) {
 457                                         fprintf(stderr, "[%s] no records in the query region.\n", __func__);
 458                                         return 1; // FIXME: a lot of memory leaks...
 459                                 }
 460                                 bgzf_seek(bp->fp, off, SEEK_SET);
 461                                 bcf_idx_destroy(idx);
 462                         }
 463                 }
 464         }
 465         while (vcf_read(bp, hin, b) > 0) {
 466                 int is_indel, cons_llr = -1;
 467                 int64_t cons_gt = -1;
 468                 double em[10];
 469                 if ((vc.flag & VC_VARONLY) && strcmp(b->alt, "X") == 0) continue;
 470                 if ((vc.flag & VC_VARONLY) && vc.min_smpl_frac > 0.) {
 471                         extern int bcf_smpl_covered(const bcf1_t *b);
 472                         int n = bcf_smpl_covered(b);
 473                         if ((double)n / b->n_smpl < vc.min_smpl_frac) continue;
 474                 }
 475                 if (vc.n_sub) bcf_subsam(vc.n_sub, vc.sublist, b);
 476                 if (vc.flag & VC_FIX_PL) bcf_fix_pl(b);
 477                 is_indel = bcf_is_indel(b);
 478                 if ((vc.flag & VC_NO_INDEL) && is_indel) continue;
 479                 if ((vc.flag & VC_ACGT_ONLY) && !is_indel) {
 480                         int x;
 481                         if (b->ref[0] == 0 || b->ref[1] != 0) continue;
 482                         x = toupper(b->ref[0]);
 483                         if (x != 'A' && x != 'C' && x != 'G' && x != 'T') continue;
 484                 }
 485                 if (vc.bed && !bed_overlap(vc.bed, hin->ns[b->tid], b->pos, b->pos + strlen(b->ref))) continue;
 486                 if (tid >= 0) {
 487                         int l = strlen(b->ref);
 488                         l = b->pos + (l > 0? l : 1);
 489                         if (b->tid != tid || b->pos >= end) break;
 490                         if (!(l > begin && end > b->pos)) continue;
 491                 }
 492                 ++n_processed;
 493                 if (vc.flag & VC_QCNT) { // summarize the difference
 494                         int x = bcf_min_diff(b);
 495                         if (x > 255) x = 255;
 496                         if (x >= 0) ++qcnt[x];
 497                 }
 498                 if (vc.flag & VC_QCALL) { // output QCALL format; STOP here
 499                         bcf_2qcall(hout, b);
 500                         continue;
 501                 }
 502                 if (vc.trio_aux) // do trio calling
 503                         bcf_trio_call(vc.trio_aux, b, &cons_llr, &cons_gt);
 504                 else if (vc.flag & VC_PAIRCALL)
 505                         cons_llr = bcf_pair_call(b);
 506                 if (vc.flag & (VC_CALL|VC_ADJLD|VC_EM)) bcf_gl2pl(b);
 507                 if (vc.flag & VC_EM) bcf_em1(b, vc.n1, 0x1ff, em);
 508                 else {
 509                         int i;
 510                         for (i = 0; i < 9; ++i) em[i] = -1.;
 511                 }
 512                 if (vc.flag & VC_CALL) { // call variants
 513                         bcf_p1rst_t pr;
 514                         int calret = bcf_p1_cal(b, (em[7] >= 0 && em[7] < vc.min_lrt), p1, &pr);
 515                         if (n_processed % 100000 == 0) {
 516                                 fprintf(stderr, "[%s] %ld sites processed.\n", __func__, (long)n_processed);
 517                                 bcf_p1_dump_afs(p1);
 518                         }
 519                         if (pr.p_ref >= vc.pref && (vc.flag & VC_VARONLY)) continue;
 520                         if (vc.n_perm && vc.n1 > 0 && pr.p_chi2 < vc.min_perm_p) { // permutation test
 521                                 bcf_p1rst_t r;
 522                                 int i, n = 0;
 523                                 for (i = 0; i < vc.n_perm; ++i) {
 524 #ifdef BCF_PERM_LRT // LRT based permutation is much faster but less robust to artifacts
 525                                         double x[10];
 526                                         bcf_shuffle(b, seeds[i]);
 527                                         bcf_em1(b, vc.n1, 1<<7, x);
 528                                         if (x[7] < em[7]) ++n;
 529 #else
 530                                         bcf_shuffle(b, seeds[i]);
 531                                         bcf_p1_cal(b, 1, p1, &r);
 532                                         if (pr.p_chi2 >= r.p_chi2) ++n;
 533 #endif
 534                                 }
 535                                 pr.perm_rank = n;
 536                         }
 537                         if (calret >= 0) update_bcf1(b, p1, &pr, vc.pref, vc.flag, em, cons_llr, cons_gt);
 538                 } else if (vc.flag & VC_EM) update_bcf1(b, 0, 0, 0, vc.flag, em, cons_llr, cons_gt);
 539                 if (vc.flag & VC_ADJLD) { // compute LD
 540                         double f[4], r2;
 541                         if ((r2 = bcf_pair_freq(blast, b, f)) >= 0) {
 542                                 kstring_t s;
 543                                 s.m = s.l = 0; s.s = 0;
 544                                 if (*b->info) kputc(';', &s);
 545                                 ksprintf(&s, "NEIR=%.3f;NEIF4=%.3f,%.3f,%.3f,%.3f", r2, f[0], f[1], f[2], f[3]);
 546                                 bcf_append_info(b, s.s, s.l);
 547                                 free(s.s);
 548                         }
 549                         bcf_cpy(blast, b);
 550                 }
 551                 if (vc.flag & VC_ANNO_MAX) bcf_anno_max(b);
 552                 if (vc.flag & VC_NO_GENO) { // do not output GENO fields
 553                         b->n_gi = 0;
 554                         b->fmt[0] = '\0';
 555                         b->l_str = b->fmt - b->str + 1;
 556                 } else bcf_fix_gt(b);
 557                 vcf_write(bout, hout, b);
 558         }
 559         if (vc.prior_file) free(vc.prior_file);
 560         if (vc.flag & VC_CALL) bcf_p1_dump_afs(p1);
 561         if (hin != hout) bcf_hdr_destroy(hout);
 562         bcf_hdr_destroy(hin);
 563         bcf_destroy(b); bcf_destroy(blast);
 564         vcf_close(bp); vcf_close(bout);
 565         if (vc.fn_dict) free(vc.fn_dict);
 566         if (vc.ploidy) free(vc.ploidy);
 567         if (vc.trio_aux) free(vc.trio_aux);
 568         if (vc.n_sub) {
 569                 int i;
 570                 for (i = 0; i < vc.n_sub; ++i) free(vc.subsam[i]);
 571                 free(vc.subsam); free(vc.sublist);
 572         }
 573         if (vc.bed) bed_destroy(vc.bed);
 574         if (vc.flag & VC_QCNT)
 575                 for (c = 0; c < 256; ++c)
 576                         fprintf(stderr, "QT\t%d\t%lld\n", c, (long long)qcnt[c]);
 577         if (seeds) free(seeds);
 578         if (p1) bcf_p1_destroy(p1);
 579         return 0;
 580 }