bcftools/call1.c

   1 #include <unistd.h>
   2 #include <stdlib.h>
   3 #include <math.h>
   4 #include <zlib.h>
   5 #include <errno.h>
   6 #include "bcf.h"
   7 #include "prob1.h"
   8 #include "kstring.h"
   9 #include "time.h"
  10
  11 #include "khash.h"
  12 KHASH_SET_INIT_INT64(set64)
  13
  14 #include "kseq.h"
  15 KSTREAM_INIT(gzFile, gzread, 16384)
  16
  17 #define VC_NO_GENO 2
  18 #define VC_BCFOUT  4
  19 #define VC_CALL    8
  20 #define VC_VARONLY 16
  21 #define VC_VCFIN   32
  22 #define VC_UNCOMP  64
  23 #define VC_KEEPALT 256
  24 #define VC_ACGT_ONLY 512
  25 #define VC_QCALL   1024
  26 #define VC_CALL_GT 2048
  27 #define VC_ADJLD   4096
  28 #define VC_NO_INDEL 8192
  29 #define VC_ANNO_MAX 16384
  30 #define VC_FIX_PL   32768
  31
  32 typedef struct {
  33         int flag, prior_type, n1, n_sub, *sublist, n_perm;
  34         char *fn_list, *prior_file, **subsam, *fn_dict;
  35         uint8_t *ploidy;
  36         double theta, pref, indel_frac, min_perm_p, min_smpl_frac;
  37 } viewconf_t;
  38
  39 khash_t(set64) *bcf_load_pos(const char *fn, bcf_hdr_t *_h)
  40 {
  41         void *str2id;
  42         gzFile fp;
  43         kstream_t *ks;
  44         int ret, dret, lineno = 1;
  45         kstring_t *str;
  46         khash_t(set64) *hash = 0;
  47
  48         hash = kh_init(set64);
  49         str2id = bcf_build_refhash(_h);
  50         str = calloc(1, sizeof(kstring_t));
  51         fp = strcmp(fn, "-")? gzopen(fn, "r") : gzdopen(fileno(stdin), "r");
  52         ks = ks_init(fp);
  53         while (ks_getuntil(ks, 0, str, &dret) >= 0) {
  54                 int tid = bcf_str2id(str2id, str->s);
  55                 if (tid >= 0 && dret != '\n') {
  56                         if (ks_getuntil(ks, 0, str, &dret) >= 0) {
  57                                 uint64_t x = (uint64_t)tid<<32 | (atoi(str->s) - 1);
  58                                 kh_put(set64, hash, x, &ret);
  59                         } else break;
  60                 } else fprintf(stderr, "[%s] %s is not a reference name (line %d).\n", __func__, str->s, lineno);
  61                 if (dret != '\n') while ((dret = ks_getc(ks)) > 0 && dret != '\n');
  62                 if (dret < 0) break;
  63                 ++lineno;
  64         }
  65         bcf_str2id_destroy(str2id);
  66         ks_destroy(ks);
  67         gzclose(fp);
  68         free(str->s); free(str);
  69         return hash;
  70 }
  71
  72 typedef struct {
  73         double p[4];
  74         int mq, depth, is_tested, d[4];
  75 } anno16_t;
  76
  77 static double ttest(int n1, int n2, int a[4])
  78 {
  79         extern double kf_betai(double a, double b, double x);
  80         double t, v, u1, u2;
  81         if (n1 == 0 || n2 == 0 || n1 + n2 < 3) return 1.0;
  82         u1 = (double)a[0] / n1; u2 = (double)a[2] / n2;
  83         if (u1 <= u2) return 1.;
  84         t = (u1 - u2) / sqrt(((a[1] - n1 * u1 * u1) + (a[3] - n2 * u2 * u2)) / (n1 + n2 - 2) * (1./n1 + 1./n2));
  85         v = n1 + n2 - 2;
  86 //      printf("%d,%d,%d,%d,%lf,%lf,%lf\n", a[0], a[1], a[2], a[3], t, u1, u2);
  87         return t < 0.? 1. : .5 * kf_betai(.5*v, .5, v/(v+t*t));
  88 }
  89
  90 static int test16_core(int anno[16], anno16_t *a)
  91 {
  92         extern double kt_fisher_exact(int n11, int n12, int n21, int n22, double *_left, double *_right, double *two);
  93         double left, right;
  94         int i;
  95         a->p[0] = a->p[1] = a->p[2] = a->p[3] = 1.;
  96         memcpy(a->d, anno, 4 * sizeof(int));
  97         a->depth = anno[0] + anno[1] + anno[2] + anno[3];
  98         a->is_tested = (anno[0] + anno[1] > 0 && anno[2] + anno[3] > 0);
  99         if (a->depth == 0) return -1;
 100         a->mq = (int)(sqrt((anno[9] + anno[11]) / a->depth) + .499);
 101         kt_fisher_exact(anno[0], anno[1], anno[2], anno[3], &left, &right, &a->p[0]);
 102         for (i = 1; i < 4; ++i)
 103                 a->p[i] = ttest(anno[0] + anno[1], anno[2] + anno[3], anno+4*i);
 104         return 0;
 105 }
 106
 107 static int test16(bcf1_t *b, anno16_t *a)
 108 {
 109         char *p;
 110         int i, anno[16];
 111         a->p[0] = a->p[1] = a->p[2] = a->p[3] = 1.;
 112         a->d[0] = a->d[1] = a->d[2] = a->d[3] = 0.;
 113         a->mq = a->depth = a->is_tested = 0;
 114         if ((p = strstr(b->info, "I16=")) == 0) return -1;
 115         p += 4;
 116         for (i = 0; i < 16; ++i) {
 117                 errno = 0; anno[i] = strtol(p, &p, 10);
 118                 if (anno[i] == 0 && (errno == EINVAL || errno == ERANGE)) return -2;
 119                 ++p;
 120         }
 121         return test16_core(anno, a);
 122 }
 123
 124 static void rm_info(bcf1_t *b, const char *key)
 125 {
 126         char *p, *q;
 127         if ((p = strstr(b->info, key)) == 0) return;
 128         for (q = p; *q && *q != ';'; ++q);
 129         if (p > b->info && *(p-1) == ';') --p;
 130         memmove(p, q, b->l_str - (q - b->str));
 131         b->l_str -= q - p;
 132         bcf_sync(b);
 133 }
 134
 135 static int update_bcf1(int n_smpl, bcf1_t *b, const bcf_p1aux_t *pa, const bcf_p1rst_t *pr, double pref, int flag)
 136 {
 137         kstring_t s;
 138         int has_I16, is_var = (pr->p_ref < pref);
 139         double fq, r = is_var? pr->p_ref : pr->p_var;
 140         anno16_t a;
 141
 142         has_I16 = test16(b, &a) >= 0? 1 : 0;
 143         rm_info(b, "I16=");
 144
 145         memset(&s, 0, sizeof(kstring_t));
 146         kputc('\0', &s); kputs(b->ref, &s); kputc('\0', &s);
 147         kputs(b->alt, &s); kputc('\0', &s); kputc('\0', &s);
 148         kputs(b->info, &s);
 149         if (b->info[0]) kputc(';', &s);
 150 //      ksprintf(&s, "AF1=%.4lg;AFE=%.4lg;CI95=%.4lg,%.4lg", 1.-pr->f_em, 1.-pr->f_exp, pr->cil, pr->cih);
 151         ksprintf(&s, "AF1=%.4g;CI95=%.4g,%.4g", 1.-pr->f_em, pr->cil, pr->cih);
 152         if (has_I16) ksprintf(&s, ";DP4=%d,%d,%d,%d;MQ=%d", a.d[0], a.d[1], a.d[2], a.d[3], a.mq);
 153         fq = pr->p_ref_folded < 0.5? -4.343 * log(pr->p_ref_folded) : 4.343 * log(pr->p_var_folded);
 154         if (fq < -999) fq = -999;
 155         if (fq > 999) fq = 999;
 156         ksprintf(&s, ";FQ=%.3g", fq);
 157         if (pr->cmp[0] >= 0.) {
 158                 int i, q[3], pq;
 159                 for (i = 1; i < 3; ++i) {
 160                         double x = pr->cmp[i] + pr->cmp[0]/2.;
 161                         q[i] = x == 0? 255 : (int)(-4.343 * log(x) + .499);
 162                         if (q[i] > 255) q[i] = 255;
 163                 }
 164                 pq = (int)(-4.343 * log(pr->p_chi2) + .499);
 165                 if (pr->perm_rank >= 0) ksprintf(&s, ";PR=%d", pr->perm_rank);
 166                 ksprintf(&s, ";QCHI2=%d;PCHI2=%.3g;PC2=%d,%d", pq, q[1], q[2], pr->p_chi2);
 167 //              ksprintf(&s, ",%g,%g,%g", pr->cmp[0], pr->cmp[1], pr->cmp[2]);
 168         }
 169         if (has_I16 && a.is_tested) ksprintf(&s, ";PV4=%.2g,%.2g,%.2g,%.2g", a.p[0], a.p[1], a.p[2], a.p[3]);
 170         kputc('\0', &s);
 171         kputs(b->fmt, &s); kputc('\0', &s);
 172         free(b->str);
 173         b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 174         b->qual = r < 1e-100? 999 : -4.343 * log(r);
 175         if (b->qual > 999) b->qual = 999;
 176         bcf_sync(b);
 177         if (!is_var) bcf_shrink_alt(b, 1);
 178         else if (!(flag&VC_KEEPALT))
 179                 bcf_shrink_alt(b, pr->rank0 < 2? 2 : pr->rank0+1);
 180         if (is_var && (flag&VC_CALL_GT)) { // call individual genotype
 181                 int i, x, old_n_gi = b->n_gi;
 182                 s.m = b->m_str; s.l = b->l_str - 1; s.s = b->str;
 183                 kputs(":GT:GQ", &s); kputc('\0', &s);
 184                 b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 185                 bcf_sync(b);
 186                 for (i = 0; i < b->n_smpl; ++i) {
 187                         x = bcf_p1_call_gt(pa, pr->f_em, i);
 188                         ((uint8_t*)b->gi[old_n_gi].data)[i] = (x&3) == 0? 1<<3|1 : (x&3) == 1? 1 : 0;
 189                         ((uint8_t*)b->gi[old_n_gi+1].data)[i] = x>>2;
 190                 }
 191         }
 192         return is_var;
 193 }
 194
 195 static char **read_samples(const char *fn, int *_n)
 196 {
 197         gzFile fp;
 198         kstream_t *ks;
 199         kstring_t s;
 200         int dret, n = 0, max = 0;
 201         char **sam = 0;
 202         *_n = 0;
 203         s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 204         fp = gzopen(fn, "r");
 205         if (fp == 0) return 0; // fail to open file
 206         ks = ks_init(fp);
 207         while (ks_getuntil(ks, 0, &s, &dret) >= 0) {
 208                 int l;
 209                 if (max == n) {
 210                         max = max? max<<1 : 4;
 211                         sam = realloc(sam, sizeof(void*)*max);
 212                 }
 213                 l = s.l;
 214                 sam[n] = malloc(s.l + 2);
 215                 strcpy(sam[n], s.s);
 216                 sam[n][l+1] = 2; // by default, diploid
 217                 if (dret != '\n') {
 218                         if (ks_getuntil(ks, 0, &s, &dret) >= 0) { // read ploidy, 1 or 2
 219                                 int x = (int)s.s[0] - '0';
 220                                 if (x == 1 || x == 2) sam[n][l+1] = x;
 221                                 else fprintf(stderr, "(%s) ploidy can only be 1 or 2; assume diploid\n", __func__);
 222                         }
 223                         if (dret != '\n') ks_getuntil(ks, '\n', &s, &dret);
 224                 }
 225                 ++n;
 226         }
 227         ks_destroy(ks);
 228         gzclose(fp);
 229         free(s.s);
 230         *_n = n;
 231         return sam;
 232 }
 233
 234 static void write_header(bcf_hdr_t *h)
 235 {
 236         kstring_t str;
 237         str.l = h->l_txt? h->l_txt - 1 : 0;
 238         str.m = str.l + 1; str.s = h->txt;
 239         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=DP,"))
 240                 kputs("##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=\"Raw read depth\">\n", &str);
 241         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=DP4,"))
 242                 kputs("##INFO=<ID=DP4,Number=4,Type=Integer,Description=\"# high-quality ref-forward bases, ref-reverse, alt-forward and alt-reverse bases\">\n", &str);
 243         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=MQ,"))
 244                 kputs("##INFO=<ID=MQ,Number=1,Type=Integer,Description=\"Root-mean-square mapping quality of covering reads\">\n", &str);
 245         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=FQ,"))
 246                 kputs("##INFO=<ID=FQ,Number=1,Type=Float,Description=\"Phred probability of all samples being the same\">\n", &str);
 247         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=AF1,"))
 248                 kputs("##INFO=<ID=AF1,Number=1,Type=Float,Description=\"Max-likelihood estimate of the site allele frequency of the first ALT allele\">\n", &str);
 249         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=CI95,"))
 250                 kputs("##INFO=<ID=CI95,Number=2,Type=Float,Description=\"Equal-tail Bayesian credible interval of the site allele frequency at the 95% level\">\n", &str);
 251         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PV4,"))
 252                 kputs("##INFO=<ID=PV4,Number=4,Type=Float,Description=\"P-values for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias\">\n", &str);
 253     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=INDEL,"))
 254         kputs("##INFO=<ID=INDEL,Number=0,Type=Flag,Description=\"Indicates that the variant is an INDEL.\">\n", &str);
 255     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PC2,"))
 256         kputs("##INFO=<ID=PC2,Number=2,Type=Integer,Description=\"Phred probability of the nonRef allele frequency in group1 samples being larger (,smaller) than in group2.\">\n", &str);
 257     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PCHI2,"))
 258         kputs("##INFO=<ID=PCHI2,Number=1,Type=Float,Description=\"Posterior weighted chi^2 P-value for testing the association between group1 and group2 samples.\">\n", &str);
 259     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=QCHI2,"))
 260         kputs("##INFO=<ID=QCHI2,Number=1,Type=Integer,Description=\"Phred scaled PCHI2.\">\n", &str);
 261     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=RP,"))
 262         kputs("##INFO=<ID=RP,Number=1,Type=Integer,Description=\"# permutations yielding a smaller PCHI2.\">\n", &str);
 263     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GT,"))
 264         kputs("##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description=\"Genotype\">\n", &str);
 265     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GQ,"))
 266         kputs("##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description=\"Genotype Quality\">\n", &str);
 267     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GL,"))
 268         kputs("##FORMAT=<ID=GL,Number=3,Type=Float,Description=\"Likelihoods for RR,RA,AA genotypes (R=ref,A=alt)\">\n", &str);
 269         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=DP,"))
 270                 kputs("##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=\"# high-quality bases\">\n", &str);
 271         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=SP,"))
 272                 kputs("##FORMAT=<ID=SP,Number=1,Type=Integer,Description=\"Phred-scaled strand bias P-value\">\n", &str);
 273         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=PL,"))
 274                 kputs("##FORMAT=<ID=PL,Number=-1,Type=Integer,Description=\"List of Phred-scaled genotype likelihoods, number of values is (#ALT+1)*(#ALT+2)/2\">\n", &str);
 275         h->l_txt = str.l + 1; h->txt = str.s;
 276 }
 277
 278 double bcf_ld_freq(const bcf1_t *b0, const bcf1_t *b1, double f[4]);
 279
 280 int bcfview(int argc, char *argv[])
 281 {
 282         extern int bcf_2qcall(bcf_hdr_t *h, bcf1_t *b);
 283         extern void bcf_p1_indel_prior(bcf_p1aux_t *ma, double x);
 284         extern int bcf_fix_gt(bcf1_t *b);
 285         extern int bcf_anno_max(bcf1_t *b);
 286         extern int bcf_shuffle(bcf1_t *b, int seed);
 287         bcf_t *bp, *bout = 0;
 288         bcf1_t *b, *blast;
 289         int c, *seeds = 0;
 290         uint64_t n_processed = 0;
 291         viewconf_t vc;
 292         bcf_p1aux_t *p1 = 0;
 293         bcf_hdr_t *hin, *hout;
 294         int tid, begin, end;
 295         char moder[4], modew[4];
 296         khash_t(set64) *hash = 0;
 297
 298         tid = begin = end = -1;
 299         memset(&vc, 0, sizeof(viewconf_t));
 300         vc.prior_type = vc.n1 = -1; vc.theta = 1e-3; vc.pref = 0.5; vc.indel_frac = -1.; vc.n_perm = 0; vc.min_perm_p = 0.01; vc.min_smpl_frac = 0;
 301         while ((c = getopt(argc, argv, "FN1:l:cHAGvbSuP:t:p:QgLi:IMs:D:U:X:d:")) >= 0) {
 302                 switch (c) {
 303                 case '1': vc.n1 = atoi(optarg); break;
 304                 case 'l': vc.fn_list = strdup(optarg); break;
 305                 case 'D': vc.fn_dict = strdup(optarg); break;
 306                 case 'F': vc.flag |= VC_FIX_PL; break;
 307                 case 'N': vc.flag |= VC_ACGT_ONLY; break;
 308                 case 'G': vc.flag |= VC_NO_GENO; break;
 309                 case 'A': vc.flag |= VC_KEEPALT; break;
 310                 case 'b': vc.flag |= VC_BCFOUT; break;
 311                 case 'S': vc.flag |= VC_VCFIN; break;
 312                 case 'c': vc.flag |= VC_CALL; break;
 313                 case 'v': vc.flag |= VC_VARONLY | VC_CALL; break;
 314                 case 'u': vc.flag |= VC_UNCOMP | VC_BCFOUT; break;
 315                 case 'g': vc.flag |= VC_CALL_GT | VC_CALL; break;
 316                 case 'I': vc.flag |= VC_NO_INDEL; break;
 317                 case 'M': vc.flag |= VC_ANNO_MAX; break;
 318                 case 't': vc.theta = atof(optarg); break;
 319                 case 'p': vc.pref = atof(optarg); break;
 320                 case 'i': vc.indel_frac = atof(optarg); break;
 321                 case 'Q': vc.flag |= VC_QCALL; break;
 322                 case 'L': vc.flag |= VC_ADJLD; break;
 323                 case 'U': vc.n_perm = atoi(optarg); break;
 324                 case 'X': vc.min_perm_p = atof(optarg); break;
 325                 case 'd': vc.min_smpl_frac = atof(optarg); break;
 326                 case 's': vc.subsam = read_samples(optarg, &vc.n_sub);
 327                         vc.ploidy = calloc(vc.n_sub + 1, 1);
 328                         for (tid = 0; tid < vc.n_sub; ++tid) vc.ploidy[tid] = vc.subsam[tid][strlen(vc.subsam[tid]) + 1];
 329                         tid = -1;
 330                         break;
 331                 case 'P':
 332                         if (strcmp(optarg, "full") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_FULL;
 333                         else if (strcmp(optarg, "cond2") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_COND2;
 334                         else if (strcmp(optarg, "flat") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_FLAT;
 335                         else vc.prior_file = strdup(optarg);
 336                         break;
 337                 }
 338         }
 339         if (argc == optind) {
 340                 fprintf(stderr, "\n");
 341                 fprintf(stderr, "Usage:   bcftools view [options] <in.bcf> [reg]\n\n");
 342                 fprintf(stderr, "Options: -c        SNP calling\n");
 343                 fprintf(stderr, "         -v        output potential variant sites only (force -c)\n");
 344                 fprintf(stderr, "         -g        call genotypes at variant sites (force -c)\n");
 345                 fprintf(stderr, "         -b        output BCF instead of VCF\n");
 346                 fprintf(stderr, "         -u        uncompressed BCF output (force -b)\n");
 347                 fprintf(stderr, "         -S        input is VCF\n");
 348                 fprintf(stderr, "         -A        keep all possible alternate alleles at variant sites\n");
 349                 fprintf(stderr, "         -G        suppress all individual genotype information\n");
 350                 fprintf(stderr, "         -N        skip sites where REF is not A/C/G/T\n");
 351                 fprintf(stderr, "         -Q        output the QCALL likelihood format\n");
 352                 fprintf(stderr, "         -L        calculate LD for adjacent sites\n");
 353                 fprintf(stderr, "         -I        skip indels\n");
 354                 fprintf(stderr, "         -F        PL generated by r921 or before\n");
 355                 fprintf(stderr, "         -d FLOAT  skip loci where less than FLOAT fraction of samples covered [0]\n");
 356                 fprintf(stderr, "         -D FILE   sequence dictionary for VCF->BCF conversion [null]\n");
 357                 fprintf(stderr, "         -l FILE   list of sites to output [all sites]\n");
 358                 fprintf(stderr, "         -t FLOAT  scaled substitution mutation rate [%.4g]\n", vc.theta);
 359                 fprintf(stderr, "         -i FLOAT  indel-to-substitution ratio [%.4g]\n", vc.indel_frac);
 360                 fprintf(stderr, "         -p FLOAT  variant if P(ref|D)<FLOAT [%.3g]\n", vc.pref);
 361                 fprintf(stderr, "         -P STR    type of prior: full, cond2, flat [full]\n");
 362                 fprintf(stderr, "         -s FILE   list of samples to use [all samples]\n");
 363                 fprintf(stderr, "         -1 INT    number of group-1 samples [0]\n");
 364                 fprintf(stderr, "         -U INT    number of permutations for association testing (effective with -1) [0]\n");
 365                 fprintf(stderr, "         -X FLOAT  only perform permutations for P(chi^2)<FLOAT [%g]\n", vc.min_perm_p);
 366                 fprintf(stderr, "\n");
 367                 return 1;
 368         }
 369
 370         if ((vc.flag & VC_VCFIN) && (vc.flag & VC_BCFOUT) && vc.fn_dict == 0) {
 371                 fprintf(stderr, "[%s] For VCF->BCF conversion please specify the sequence dictionary with -D\n", __func__);
 372                 return 1;
 373         }
 374         if (vc.n1 <= 0) vc.n_perm = 0; // TODO: give a warning here!
 375         if (vc.n_perm > 0) {
 376                 seeds = malloc(vc.n_perm * sizeof(int));
 377                 srand48(time(0));
 378                 for (c = 0; c < vc.n_perm; ++c) seeds[c] = lrand48();
 379         }
 380         b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 381         blast = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 382         strcpy(moder, "r");
 383         if (!(vc.flag & VC_VCFIN)) strcat(moder, "b");
 384         strcpy(modew, "w");
 385         if (vc.flag & VC_BCFOUT) strcat(modew, "b");
 386         if (vc.flag & VC_UNCOMP) strcat(modew, "u");
 387         bp = vcf_open(argv[optind], moder);
 388         hin = hout = vcf_hdr_read(bp);
 389         if (vc.fn_dict && (vc.flag & VC_VCFIN))
 390                 vcf_dictread(bp, hin, vc.fn_dict);
 391         bout = vcf_open("-", modew);
 392         if (!(vc.flag & VC_QCALL)) {
 393                 if (vc.n_sub) {
 394                         vc.sublist = calloc(vc.n_sub, sizeof(int));
 395                         hout = bcf_hdr_subsam(hin, vc.n_sub, vc.subsam, vc.sublist);
 396                 }
 397                 if (vc.flag & VC_CALL) write_header(hout);
 398                 vcf_hdr_write(bout, hout);
 399         }
 400         if (vc.flag & VC_CALL) {
 401                 p1 = bcf_p1_init(hout->n_smpl, vc.ploidy);
 402                 if (vc.prior_file) {
 403                         if (bcf_p1_read_prior(p1, vc.prior_file) < 0) {
 404                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to read the prior AFS.\n", __func__);
 405                                 return 1;
 406                         }
 407                 } else bcf_p1_init_prior(p1, vc.prior_type, vc.theta);
 408                 if (vc.n1 > 0) {
 409                         bcf_p1_set_n1(p1, vc.n1);
 410                         bcf_p1_init_subprior(p1, vc.prior_type, vc.theta);
 411                 }
 412                 if (vc.indel_frac > 0.) bcf_p1_indel_prior(p1, vc.indel_frac); // otherwise use the default indel_frac
 413         }
 414         if (vc.fn_list) hash = bcf_load_pos(vc.fn_list, hin);
 415         if (optind + 1 < argc && !(vc.flag&VC_VCFIN)) {
 416                 void *str2id = bcf_build_refhash(hout);
 417                 if (bcf_parse_region(str2id, argv[optind+1], &tid, &begin, &end) >= 0) {
 418                         bcf_idx_t *idx;
 419                         idx = bcf_idx_load(argv[optind]);
 420                         if (idx) {
 421                                 uint64_t off;
 422                                 off = bcf_idx_query(idx, tid, begin);
 423                                 if (off == 0) {
 424                                         fprintf(stderr, "[%s] no records in the query region.\n", __func__);
 425                                         return 1; // FIXME: a lot of memory leaks...
 426                                 }
 427                                 bgzf_seek(bp->fp, off, SEEK_SET);
 428                                 bcf_idx_destroy(idx);
 429                         }
 430                 }
 431         }
 432         while (vcf_read(bp, hin, b) > 0) {
 433                 int is_indel;
 434                 if ((vc.flag & VC_VARONLY) && strcmp(b->alt, "X") == 0) continue;
 435                 if ((vc.flag & VC_VARONLY) && vc.min_smpl_frac > 0.) {
 436                         extern int bcf_smpl_covered(const bcf1_t *b);
 437                         int n = bcf_smpl_covered(b);
 438                         if ((double)n / b->n_smpl < vc.min_smpl_frac) continue;
 439                 }
 440                 if (vc.n_sub) bcf_subsam(vc.n_sub, vc.sublist, b);
 441                 if (vc.flag & VC_FIX_PL) bcf_fix_pl(b);
 442                 is_indel = bcf_is_indel(b);
 443                 if ((vc.flag & VC_NO_INDEL) && is_indel) continue;
 444                 if ((vc.flag & VC_ACGT_ONLY) && !is_indel) {
 445                         int x;
 446                         if (b->ref[0] == 0 || b->ref[1] != 0) continue;
 447                         x = toupper(b->ref[0]);
 448                         if (x != 'A' && x != 'C' && x != 'G' && x != 'T') continue;
 449                 }
 450                 if (hash) {
 451                         uint64_t x = (uint64_t)b->tid<<32 | b->pos;
 452                         khint_t k = kh_get(set64, hash, x);
 453                         if (kh_size(hash) == 0) break;
 454                         if (k == kh_end(hash)) continue;
 455                         kh_del(set64, hash, k);
 456                 }
 457                 if (tid >= 0) {
 458                         int l = strlen(b->ref);
 459                         l = b->pos + (l > 0? l : 1);
 460                         if (b->tid != tid || b->pos >= end) break;
 461                         if (!(l > begin && end > b->pos)) continue;
 462                 }
 463                 ++n_processed;
 464                 if (vc.flag & VC_QCALL) { // output QCALL format; STOP here
 465                         bcf_2qcall(hout, b);
 466                         continue;
 467                 }
 468                 if (vc.flag & (VC_CALL|VC_ADJLD)) bcf_gl2pl(b);
 469                 if (vc.flag & VC_CALL) { // call variants
 470                         bcf_p1rst_t pr;
 471                         bcf_p1_cal(b, p1, &pr); // pr.g[3] is not calculated here
 472                         if (n_processed % 100000 == 0) {
 473                                 fprintf(stderr, "[%s] %ld sites processed.\n", __func__, (long)n_processed);
 474                                 bcf_p1_dump_afs(p1);
 475                         }
 476                         if (pr.p_ref >= vc.pref && (vc.flag & VC_VARONLY)) continue;
 477                         if (vc.n_perm && vc.n1 > 0 && pr.p_chi2 < vc.min_perm_p) { // permutation test
 478                                 bcf_p1rst_t r;
 479                                 int i, n = 0;
 480                                 for (i = 0; i < vc.n_perm; ++i) {
 481                                         bcf_shuffle(b, seeds[i]);
 482                                         bcf_p1_cal(b, p1, &r);
 483                                         if (pr.p_chi2 >= r.p_chi2) ++n;
 484                                 }
 485                                 pr.perm_rank = n;
 486                         }
 487                         update_bcf1(hout->n_smpl, b, p1, &pr, vc.pref, vc.flag);
 488                 }
 489                 if (vc.flag & VC_ADJLD) { // compute LD
 490                         double f[4], r2;
 491                         if ((r2 = bcf_ld_freq(blast, b, f)) >= 0) {
 492                                 kstring_t s;
 493                                 s.m = s.l = 0; s.s = 0;
 494                                 if (*b->info) kputc(';', &s);
 495                                 ksprintf(&s, "NEIR=%.3f;NEIF=%.3f,%.3f", r2, f[0]+f[2], f[0]+f[1]);
 496                                 bcf_append_info(b, s.s, s.l);
 497                                 free(s.s);
 498                         }
 499                         bcf_cpy(blast, b);
 500                 }
 501                 if (vc.flag & VC_ANNO_MAX) bcf_anno_max(b);
 502                 if (vc.flag & VC_NO_GENO) { // do not output GENO fields
 503                         b->n_gi = 0;
 504                         b->fmt[0] = '\0';
 505                         b->l_str = b->fmt - b->str + 1;
 506                 } else bcf_fix_gt(b);
 507                 vcf_write(bout, hout, b);
 508         }
 509         if (vc.prior_file) free(vc.prior_file);
 510         if (vc.flag & VC_CALL) bcf_p1_dump_afs(p1);
 511         if (hin != hout) bcf_hdr_destroy(hout);
 512         bcf_hdr_destroy(hin);
 513         bcf_destroy(b); bcf_destroy(blast);
 514         vcf_close(bp); vcf_close(bout);
 515         if (hash) kh_destroy(set64, hash);
 516         if (vc.fn_list) free(vc.fn_list);
 517         if (vc.fn_dict) free(vc.fn_dict);
 518         if (vc.ploidy) free(vc.ploidy);
 519         if (vc.n_sub) {
 520                 int i;
 521                 for (i = 0; i < vc.n_sub; ++i) free(vc.subsam[i]);
 522                 free(vc.subsam); free(vc.sublist);
 523         }
 524         if (seeds) free(seeds);
 525         if (p1) bcf_p1_destroy(p1);
 526         return 0;
 527 }